使用DNA制备试剂盒自动制备小基因组的文库

摘要
三个图书馆准备工具包-Illumina®DNA准备工具包，KAPA®超级准备工具包和NEBNext®Ultra™II试剂盒-都是通过Opentrons OT-2自动快速和稳健地制备下一代测序的高质量文库。
从lambda和人类基因组DNA中制备了100 ng输入的文库。
观察到库的类似性能，用OT-2上的三个套件准备的样本变异性和产量。类似的排序指标，如条形码平衡和序列比对也观察到覆盖范围。

介绍
DNA文库的制备是下一步工作的关键步骤代测序（NGS）。自动化的DNA文库制备为构建高产测序文库提供了一种简化的方法同时尽量减少实际操作时间。在这里，我们描述海百合DNA制备自动化的效率装备(伊利，CatNo。20018705)，KAPA超级试剂盒(罗氏®. , CatNo.7962363001)和NEBNext超II试剂盒(新英格兰生物实验室®. , CatNo.E7645L)在OT-2机器人液体处理平台上。

材料和方法
Illumina DNA制备试剂盒、KAPA超级制备试剂盒、NEBNext Ultra II和视中心OT-2平台概述
拥有专利NGS标记工作流程，利用珠联转座体，这不同于KAPA HyperPrep和NEBNext Ultra II工作流程-DNA末端修复和a尾的解决流程。

对于Illumina DNA准备试剂盒，使用OT-2上的双索引适配器对DNA进行标记和标记。DNA样品（n=8,100 ng）量化，归一化到一个4 nM的库，汇集到一个多路复用的样本，然后在一个2x75上运行在Illumina MiSeq上的流式细胞进行基因组测序。工作流程包括生成DNA准备库Lambda（n=24）和人类基因组DNA样本（n=8）。

对于HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA制备试剂盒，我们在OT-2上构建了抗体DNA片段（n=8,100 ng）的DNA文库。使用的条形码来自KAPA独特的双索引适配器，和NEB多重双索引II为NEBNext索引设置1。样本被定量、归一化，并汇集到一个4 nM的文库中，并在一个带有2x75的MiSeq上进行测序流路池该工作流程包括为=片段DNA（n=24）和人类基因组DNA（n=8）生成文库。

测序数据由Illumina公司进行解复用
基本空间®根据适配器的条形码序列，并与参考基因组对齐。利用Geneious技术对该基因组的覆盖图谱进行了分析®主要的2021.2.21. 我们的数据显示了较低的样本变异性和在OT-2上使用DNA制备试剂盒制备的文库的可靠一致性。

OT-2工作流协议的原理图

对于Illumina的DNA准备试剂盒，DNA和IDT®为了伊利DNA/RNA UD指数集A。.
在OT-2上进行了标记（图1）。A
清洗步骤是必要的，以去除残留的DNA和适配器接下来，使用具有可编程盖子和块温度的OT-2甲板上热循环器进行PCR扩增。

对于HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA制备试剂盒，都用NEB片段酶进行片段化。
人类16分钟，人类20分钟基因组DNA，然后用AMPure进行清理®XP珠子(贝克曼库尔特，CatNo。. A63881).对OT-2进行DNA末端修复/A尾迹，然后是AMPure XP珠子清理步骤、条形码或适配器连接（图1）。使用的条形码来自KAPA独特的双索引适配器(罗氏，CatNo。08861919702). 对于HyperPrep和NEB多重双索引引物集1 (NEB，CatNo。E7335L)为NEBNext Ultra II。.

使用甲板上的热循环器在OT-2上进行DNA扩增。

工作流布局
Opentrons OT-2平台的布局包括模块、实验室软件和DNA准备试剂（图2）。
虽然工作流程包括在OT-2上的自动移液，但需要手动干预，在甲板上的恒温器和磁块之间移动样品板，并在此期间重置移液管尖端架协议。

图2：OT-2甲板布局

模块，实验室软件，和DNA准备试剂。这个

标准化的甲板布局与HyperPrep和其他平台共享

NEB下一个Ultra II。该工作流程在OT-2上自动移液，需要手动干预在甲板上恒温笔和之间移动样品板(1)

磁性磁块(2)，以及在运行过程中重置尖端机架。甲板布局包括1个NEST 12井储层，1 x 96井铝块，1个热循环器上的200µl PCR板，温度模块上的1个NEST0.1 mL PCR板(3)。模块包括一个磁性模块、温度模块、热循环器模块，以及P20和P300 8通道移液管。

结果
DNA文库扩增
使用PicoGreen检测DNA文库®在一个量子位®4.用荧光计测定浓度。CV（变异系数为标准差除以平均值）。所有文库的最终洗脱体积均为30µL。对于使用Illumina准备的库
DNAPrep（n=8,100ng）的CV为10.7%（n=24,100 ng）的CV为16.6%（表1A）。为文库使用HyperPrep制备，CV为（n=8100ng）的13.4%，（n=24100ng）的CV为17.6

. 1B)使用NEBNext Ultra II制备的文库显示（=8）的CV为12.1%，（=24）的CV为14.5%
（表1C)。在OT-2上制备的lambda和人类DNA文库的产量（ng/µl）、CV（%）和片段大小（bp）的比较见表2。

DNA制备文库的小基因组测序
多路复用的DNA准备文库(n=8,100在Illumina上使用2x75流动细胞进行测序MiSeq仪器。第二批DNA准备文库（n=24,100 ng）在OT-2上的3个单独的列中进行处理，以解释一批内的任何柱间可变性。安捷伦®5300年碎片分析仪计算

用DNA制备文库的片段大小来确定
在OT-2上制备的文库的可靠均匀性（表3A-3C）。同样，在OT-2上构建的48 kb基因组的一致测序覆盖显示了8倍路DNA制备文库的一致性
（表4）。

条形码平衡是准确的DNA准备样本显示的平均11.2%–12.31%的伊利米纳
DNA Prep，KAPA HyperPrep的10.6%–14.1%，NEBNextUltraII的10.5%–14.6%（图3）.
比较DNA制备试剂盒的尖端分配和OT-2方案的持续时间（表5）。

结论
我们验证了免疫DNA准备，KAPA超准备，和NEBNext Ultra II在OT-2和演示了它在下一代测序的文库制备中的应用。我们发现，DNA Prep样本在复制和化学中表现出低可变性，甚至样本条形码平衡，并且高序列比对的覆盖范围，表明OT-2可以用来可靠地自动化制备高质量的DNA文库。

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