J Proteome Res | Opentrons Flex赋能微量分泌组蛋白质组学，实现单胚胎无创检测

    分泌组（Secretome）能够反映细胞功能状态、发育过程及微环境变化，是细胞治疗、发育生物学、肿瘤研究和辅助生殖等领域的重要研究对象。然而，传统分泌组蛋白质组学通常需要毫升级培养液，样品前处理复杂、自动化程度有限，难以满足微量样本及高通量分析需求。

    近日，中国医学科学院系统医学研究院叶子璐研究员团队联合苏州大学附属第二医院张弘教授团队，在 Journal of Proteome Research 发表最新研究成果。研究团队基于模块化的 Opentrons Flex 自动化移液工作站建立自动化微体积分泌组蛋白质组学工作流，实现了仅用 20 μL 培养液开展高深度分泌组分析，并成功应用于单胚胎培养液的无创检测。

研究团队围绕微量样本条件下如何兼顾蛋白回收率、检测深度与自动化通量进行了系统优化。

1. 微量分泌组预处理策略筛选

首先，团队以HEK293T细胞条件培养液为模型，对“丙酮沉淀、直接酶解和真空离心浓缩—复溶法（CRC）” 三种微量分泌组预处理策略进行比较，从蛋白回收率、鉴定数量、数据质量和重复性等方面评估其性能。

2. 自动化磁珠样品制备

研究团队利用Opentrons Flex自动化移液工作站，对不同类型磁珠富集方案进行优化，比较亲水羟基磁珠与SAX磁珠在微量蛋白质组制备中的表现。

3. 两类典型应用场景：

• HEK293T 细胞分泌组动态监测：连续采集 20 μL 培养液分析细胞不同培养阶段的分泌蛋白变化；

• 单胚胎无创分泌组分析：从单枚小鼠胚胎培养液中获取20 μL样本，实现不同发育阶段的蛋白质组检测。

图2   自动化微量分泌组工作流的两类应用与采样设计

1. 建立适用于微量样本的自动化分泌组工作流

通过对预处理策略与磁珠富集方案的系统筛选，研究团队将浓缩—复溶法（CRC）、SAX磁珠蛋白富集与Opentrons Flex自动化移液工作站整合，建立了适用于不足20 μL条件培养液的自动化分泌组样品制备流程。磁珠结合、洗涤、还原烷基化和酶解等步骤可在单块96孔板内完成，减少人工转移造成的样品损失，并支持超过96个样本/天的标准化处理。

图3   三种分泌组预处理策略的性能比较

图4   亲水羟基磁珠与SAX磁珠的分泌组制备性能比较

2. 微量连续取样，实现高深度分泌组动态监测

在优化后的自动化工作流下，研究团队仅使用 20 μL HEK293T 细胞培养液，即可稳定鉴定 3000余种蛋白，在显著降低样本消耗的同时，仍获得丰富的分泌组信息。

进一步地，研究团队对细胞培养过程进行多时间点微量连续采样。结果显示，随着培养时间延长，蛋白种类和丰度发生明显变化；主成分分析及时间序列分析均能够区分不同培养阶段，证明该工作流能够灵敏反映细胞状态变化。

图5   HEK293T细胞分泌组的时间动态变化

3. 实现单胚胎培养液无创蛋白质组分析

研究团队将该工作流应用于单枚小鼠胚胎培养液分析，结果显示，每枚胚胎平均可鉴定约 220 种蛋白，不同发育阶段均表现出特异性的分泌组特征，并筛选出多个具有潜力的候选生物标志物。其中，Sdc4 在囊胚阶段特异性表达，显示出作为胚胎质量评价分子标志物的研究潜力。

图6   单胚胎培养液的无创分泌组分析

本研究建立了一套基于 Opentrons Flex 的自动化微体积分泌组蛋白质组学工作流，实现了微量样本条件下高灵敏度、高重复性和高通量的蛋白质组分析。

该工作流具有以下优势：

• 样本需求低：20 μL 培养液即可开展深度分析；

• 检测深度高：实现 3000 余种蛋白覆盖；

• 自动化程度高：支持 96 孔板自动化处理，提高实验效率与重复性；

• 应用范围广：适用于细胞状态监测、微量培养体系及单胚胎等珍贵样本分析。

该研究进一步拓展了自动化蛋白质组学在微量样本分析中的应用，为分泌组研究及辅助生殖等领域提供了新的技术方案，也展示了 Opentrons Flex 在自动化蛋白质组样品制备中的应用潜力。