科研加速 | Flex Prep全自动移液工作站特惠来袭!
查看详情-
文章 · 2024年12月02日
Opentrons Flex 磁珠蛋白纯化工作站进行蛋白定量的流程
阅读全文 -
文章 · 2024年12月02日
文库构建原理
阅读全文 -
文章 · 2024年12月02日
蛋白质定量测量方法类别
阅读全文
作者
Boren Lin,PhD',Kinnari Watson,PhD 1Opentrons Labworks,Inc.
摘要
本次测试研究的是在 Opentrons OT-2 自动化移液工作站上进 行基于磁珠的固定化金属亲和层析法 (IMAC) 。 我们使用 PierceTM Ni-NTA 磁性琼脂糖珠 (Thermo Fisher Scientific, USA) 测试了该方案,用于在OT-2 上提取目标蛋白(带有 His 标签的 GAPDH), 使用裂解缓冲液稀释的重组 GAPDH 蛋白、HEp-2 细胞裂解液和菌细胞制备的样品。
关键发现
在Opentrons 蛋白质纯化工作站上可使用 Ni-NTA 磁珠进行重组 GAPDH 蛋白纯化。
■ 实验结果证明所得蛋白为目标蛋白,具有良好的一致性和 特异性。
■ i该方案可以处理多达96个样品,并最大限度地减少需要手动操作的时间。
简介
蛋白质纯化的目的是为了获得高纯度的稳定活性蛋白质,以供下游分析、研究或治疗使用。固定化金属亲和层析法 (IMAC)利用金属离子提取具有基因工程标签的重组蛋白,能够螯合金 属离子的肽链。镍-三乙醇胺四乙酸 (Ni-NTA) 与琼脂糖树脂 或磁珠结合是常用的 IMAC 工具,用于纯化多组氨酸 (His) 标 记的蛋白质。由于His残基可以整合镍离子(Ni?+),His 标记的蛋白对固定了 Ni2* 的载体表现出很强的亲和力。在 Opentrons 蛋白质纯化工作站上使用 Pierce Ni-NTA 琼脂糖磁珠提取带有 His标签的GAPDH。
材料和方法
IMAC Protocol 实验流程概述
IMAC protocol 的流程分为几个部分:
第一部分:样品/磁珠混合物的制备。目标捕获部分不在OT-2平台上进行。
第二部分:洗涤和洗脱。具体流程如图1所示。
第一部分和第二部分都在OT-2 上执行。针对96个样品,第一 部分运行时间为57分钟,随后在摇床上进行30分钟的目标捕获。第二部分需要78分钟完成。
OT-2 平台上的 Ni-NTA 实验流程
第一部分和第二部分的设备布局图如下(见图2)。协议的第 一部分和第二部分均在 OT-2 平台上进行,并使用磁珠纯化模 块将磁珠从溶液中分离出来。样品处理过程中,将500 μL 人 源 His标记的 GAPDH 溶液与12.5 μL 沉淀的磁珠混合,并在 室温下以800 rpm 的速度孵育30分钟。经过2 个洗涤步骤 后,目标蛋白在250 μL 洗脱缓冲液中以800 rpm 和室温的条 件在摇床上洗脱10分钟。取20 μL 洗脱物进行 SDS-PAGE 和 Western Blot 分析,使用单克隆抗-GAPDH 抗体 (Thermo Fisher Scientific,USA)和与荧光染料偶联的二抗 (LI-COR Biosciences,USA) 进行检测。
结果
GAPDH 在重复实验中提取得到 一 致的样品处理结果(通过Western blot 分析的蛋白带信号测定, CV=6%) ( 图3)。部分提取物通过使用 QubitTM 蛋 白 质 分 析 (ThermoFisher Scientific,USA) 进行定量,证明了高蛋白质产量( 图 4A) 。 此 外 , 使 用Opentrons 蛋白质纯化工作站进行 的蛋白质纯化过程不会破坏蛋白质的酶活性,这是通过GAPDH 活 性 分 析 (Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)检 测 得 出 的 ( 图 4B)。
Ni-NTA 介导的敲低实验对于在细胞或组织样本中分离 外源表达的 His 标记蛋白质非常有用。上一个方案用于纯 化 2 0 0 μLHEp-2 细胞裂解液中的 His 标 记 GAPDH。
结果再次证明 His-GAPDH 成功被提取,并且与非标记 蛋白的结合相比,Ni-NTA 磁珠的亲和力特异性非常高 (图5)。在大规模蛋白质生产中,常用大肠杆菌进行重组蛋白表达。通过裂解带有或不带 IPTG 诱导的 His标记 GAPDH 表达的细菌细胞来制备细胞裂解液。结果进一步确认了该方案成功地使用 Ni-NTA 磁珠进行了带有 His 标 记 的 蛋 白 质 纯 化 ( 图 6 ) 。
在这项研究中处理了96个样本,显示的结果仅为在96 孔样品板的最后 一 列中的8个样品。同时,实验结果也对不同样本规模的运行时间进行了评估(图7)。
结论
本次研究在 Opentrons 蛋白质纯化工作站上运行了一种基于磁珠的 His 标记重组 GAPDH 蛋白质纯化的自动化实验流程解 决方案。实验证明, Opentrons 蛋白质纯化工作站可以在中到高通量的设置中稳定高效地处理样本,减少操作时间,同时提供符合预期的可重复性的产出。
经验丰富的服务团队和强大的生产支持团队为客户提供无忧的订单服务。