序列准备全自动微生物和人类DNA模板的文库制备

作者
雷德和金纳里·沃森

摘要
Swift 2S Turbo DNA库套件是完全自动化的，使用中心OT-2快速，放手，高为Illumina下一代测序提供的高质量文库。
主要发现
.8个序列准备的DNA文库可以在3小时内构建。
.分析了326bp和330bp的目标插入物大小人类基因组DNA。
.低PCR偏倚，说明微生物和人类文库的PCR重复水平为分别为0.02%和0.01%。
.在OT-2运行过程中保持高DNA覆盖率，通过相似的reads百分比来描述对齐：微生物文库占95.4%，人类文库占96.4%。
.可靠和精确的性能视子热循环器模块与第三方热循环器相比，通过相似的产率为5.1ng/µland 7.36ng/µl，CVs分别为13%和14%。

介绍
下一代测序（NGS）文库制备是RNA或DNA片段的过程酶法测序用的使用NGS库的准备正在迅速增加，为医疗保健和生命科学的研究人员提供了各种工作流程，以实现更快、更容易和更高的成本分析和解释大型基因组数据集的有效方法(1)。Swift 2S涡轮DNA文库准备

支持对各种样品的文库准备
分子应用。这个自动化友好的工作流是压缩的，但要手动完成工作流仍然会出现移液错误，需要几个错误吗几个小时完成。在这里，我们说明了Swift 2S涡轮文库制备微生物的完全自动化以及人类基因组DNA。复杂的库制备可以完全自动化的视中心OT- 2，模块，实验室软件，和欧米茄生物-tek标记结合®纯NGS珠子。

材料和方法
制备了350bp插入大小的文库~560bp文库使用人类基因组DNA(科里氏菌. NA12878)和Ecoli（ER2925）gDNA的GC含量分别为40和50%。每个opentronOT-2运行包含7个重复，每个运行包含5个或10个PCR周期，取决于启动输入。使用的结扎母混合包括1：10稀释的试剂W4以减少适配器二聚体。每个文库都在Illumina MiSeq Nano v2 2x250试剂盒上进行测序。视转子热循环器模块和温度模块用于主动冷却主混合，索引和样本使用Omega-Beo-tekMag-Bind®进行基于珠子的清理纯NGS珠子(2)。这些模块共同允许这个复合工作流的完全自动化（图1）。
OT-2使用P300GEN2 8通道移液管和P50 GEN2单通道移液管进行运行E.大肠杆菌gDNA，P300GEN2 8通道移液管和P20 GEN2单通道移液管与人类gDNA一起运行。然而，我们推荐P20
. GEN2单通道移液管每次运行，使用3个尖端（图1）。总运行时间，包括动手时间和机器人运行时间，约为3小时（图2）。峰值片段大小使用安捷伦2100生物分析仪fastq文件确定.

使用星系(7)中的FASTQC V0.11.9 (3)、BOWTIE2 (4)、Qualimap- BAMQC (5)和Bam覆盖V2.4.1.0 (6)进行分析，以确定覆盖率、插入大小、读取与基因组对齐、GC含量和重复百分比。BWA对齐器V1.1.4进行进一步分析。

结果
文库的产量具有很高的可重复性和可比性
在同一运行范围内的跨样本和跨物种。Ecoli gDNA输入100 ng，人gDNA输入77 ng。. . Ecoli文库的工作流程包括10个PCR循环，平均浓度为20.34ng/µl7%的变异系数（CV）。人类gDNA文库工作流程包括5个PCR周期，平均周期为. 该文库具有可比性，平均峰片段大小为591bp，CV为7%. 人类文库的平均峰值片段大小为569bp，CV为4%。产量和峰值片段大小CV显示了不同井和不同物种之间的一致性（图3）。
测序指标在不同样本和不同物种之间也具有可比性。大肠杆菌和人类文库的平均插入物大小分别为326和330 bp，与根据试剂规格纳入直接测序的DNA目标长度相对应。两个实验都显示了约95%的读取映射时与参考基因组序列对齐，高DNA回收率和大小选择始终保留每次运行，以非常低的PCR重复来说明（图4）。. 在Ecoli样本（图S1）和人类样本（图S2）中的一致覆盖显示了相同的性能和序列表示。而且单核苷酸变异（SNV）rs6061194为这进一步演示了性能（图S3）。最后，对中心热循环器模块的性能类似于手动第三方热循环器(8)，在产量和CV上具有共性。产率分别为5.1ng/µland和7.36ng/µland该端到端Opentrons库制备系统的精度和可靠性（表1）。

结论
Opentrons OT-2可以一次提供8个或更多的高质量库，至少不到3个小时，最终减少了手动移液错误的风险，并节省了用户时间。
.可重复的和一致的测序指标在微生物和人类文库的产量、CV、插入大小、对齐、PCR重复和覆盖方面。
.当产率和CV为时，视中心热循环器模块的可靠和精确的性能与第三方热循环器相比。

图1. Swift 2S涡轮增压工作流程和OpSwift 2STurbo DNA文库试剂盒©协议。该布局包括P20 GEN2单通道移液管和P300GEN2 8通道移液管。模块要求包括视中心热循环器模块，温度模块和磁性模块。这个实验室器皿要求包括两个NEST 0.1ml 96孔PCR板全裙，一个NEST深12孔储液器，三个NEST 2ml螺帽管和中心24孔铝块。