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应用笔记 | 基于Flex的血浆细胞外囊泡N-糖基化蛋白质组学分析流程

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是由细胞分泌到外周环境中的双分子层囊泡结构，内含多种生物活性分子，表面携带蛋白、脂质和糖萼，可介导细胞通讯与免疫调节等重要生命过程。蛋白糖基化作为调控生命稳态与介导病理进程的关键翻译后修饰，系统解析EVs的糖基化修饰谱图，对于实现疾病早期诊断和病程动态监测具有重要的临床转化意义。

北京大学王初教授携其在成都前沿交叉生物技术研究院的团队，开发了一种 DSPE 功能化磁珠介质，解决了EVs纯化在通量、成本等方面的局限性查看详细方案。在此工作基础上，团队进一步整合Opentrons Flex 自动化移液工作站与血浆细胞外囊泡蛋白质组前处理流程、自动化脱盐技术与亲水作用（HILIC）富集糖肽步骤，搭建了一套完整的细胞外囊泡N-糖基化蛋白质组样本自动化制备工作流。该策略可实现完整N-糖肽高覆盖深度鉴定，同时有效弥补传统分析方法通量低、耗时久的固有缺陷，大幅提升大规模临床队列样本的解析效率，在疾病相关生物标志物挖掘领域具备突出的应用转化价值。

实验流程图

一

实验方法

样本预处理

取500 μL血浆样本，于 4 ℃、3000 g 条件下离心 30 min，收集上清。

自动化胞外囊泡蛋白质组学样本制备（由 Opentrons Flex 全自动完成）

1. 加入体液样本及对应磁珠，于室温振荡孵育 10 min，弃去上清；

2. 磁吸分离 beads，使用PBS 洗去杂蛋白，重复三次；

3. 加入裂解缓冲液，裂解细胞，DTT-IAA；

4. 采用 SP3 方法进行蛋白纯化，洗去杂质；

5. 加入酶切缓冲液，37℃ 振荡酶切；

6. 收集上清，真空干燥后供后续检测。

自动化脱盐（由 Opentrons Flex 全自动完成）

自填C18脱盐柱结合Flex工作站自动化正压固相萃取仪进行脱盐。

亲水作用（HILIC）富集糖肽

利用糖肽的亲水特性富集完整N-糖肽。

质谱检测

重悬样本，取 200 ng 用于质谱分析，本实验使用质谱仪器为 timsTOF Pro2。

二

实验结果

1.稳定性测试

本研究以血浆为例，使用 Opentrons Flex 自动化制备平台进行样本处理与人工进行糖肽富集，同时人工同步进行制备，最后使用 timsTOF Pro2 进行糖肽检测。实验分三天进行，每天三个技术重复，共9个样本。三天独立操作的所有样本，糖蛋白鉴定数目稳定在180左右，完整N-糖肽鉴定数目稳定在2200左右。三次独立操作的移液工作站+人工处理后的完整N-糖肽定量CV值中位数保持在12%以内，实验流程稳定。

图1 移液工作站自动化处理样品加人工富集糖肽得到的糖蛋白和完整N-糖肽鉴定数（左）。三天独立运行，设置三个重复，绘制完整N-糖肽的定量CV图（右）。

2.重复之间的相关性

如图所示，对Opentrons Flex自动化平台制备结果进行分析，多次重复间的完整N-糖肽定量信号进行两两比较，组内R² 能够保持在0.92以上，组间R² 保持在0.84以上，表现出较高的相关性。

图2 多次重复间的完整N-糖肽定量信号进行两两比较的

皮尔逊相关系数图

结论

本研究依托 Opentrons Flex 全自动移液工作站，成功构建了一套适用于细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）N-糖基化蛋白质组学样本制备的实验平台。与传统人工操作相比，该平台表现出良好的运行稳定性和批次处理能力，单批次可高效处理 96 份样本，并可在 3 天内完成从 EVs 富集至质谱检测前处理的全流程，显著提升大队列样本的处理效率与通量。

在项目研发过程中，研究团队利用QE Plus质谱仪完成了该制备流程的可行性验证，并通过timsTOF Pro2质谱仪明确了该实验流程下EVs蛋白质组学的覆盖深度。最后将该自动化平台与EVs的N糖基化蛋白质组学分析技术相结合，实现了对EVs中完整N-糖肽的高通量、高灵敏度鉴定，为大规模临床样本的糖基化生物标志物筛选提供了可靠的技术支撑。研究表明，该平台不仅提高了样本制备效率，更可能推动EVs糖蛋白质组学在疾病诊断与机制研究中的深入应用，展现了自动化技术在复杂生物样本分析中的巨大潜力与应用价值。

笔记作者：肖伟弟、曾嘉明，北京大学成都前沿交叉生物技术研究院