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NGS(Next Generation Sequencing,下一代测序)建库工作站的操作步骤通常涉及多个复杂的分子生物学过程,旨在将待测序的DNA或RNA样本转化为适合高通量测序仪的文库。以下是一个基于通用原理的NGS建库工作站操作步骤概述,但具体步骤可能会因不同的建库方法、样本类型以及所使用的设备和试剂而有所不同,本文内容仅供参考:
NGS建库工作站操作步骤概述
1、样本准备
1>获取样本:从生物体(如细胞、组织、血液等)中提取DNA或RNA。
2>质量控制:评估样本的质量和数量,确保满足建库要求。
2、核酸片段化
1>DNA片段化:对于DNA建库,通常使用物理方法(如超声波、酶切)将DNA打成一定长度的小片段(如200-500bp)。
2>RNA片段化:对于RNA建库,特别是mRNA建库,需要先进行mRNA纯化,然后进行片段化处理(如使用金属离子、酶处理等)。
3、末端修复与加尾
1>DNA末端修复:使用末端修复酶对片段化的DNA进行5’端磷酸化和3’端加A处理,以便于后续接头的连接。
2>RNA反转录:对于RNA建库,需要将片段化的RNA反转录成cDNA,然后进行类似DNA的末端修复和加尾处理。
4、接头连接
1>接头设计:根据测序平台的要求设计合适的接头序列。
2>接头连接:使用DNA连接酶将接头连接到处理好的DNA或cDNA片段的两端。
5、文库扩增
1>PCR扩增:通过PCR反应扩增连接了接头的DNA或cDNA片段,以增加文库中的目标序列浓度。
2>质量控制:对扩增后的文库进行质量控制,评估其浓度、纯度和片段大小分布。
6、文库纯化
1>磁珠纯化:使用磁珠等方法去除文库中的杂质(如引物、盐离子等),提高文库的纯度。
2>定量检测:使用qPCR等方法对纯化后的文库进行定量检测,以便于后续测序时的样本分配。
7、文库质检与存储
1>质检:对最终文库进行质量检查,确保其满足测序要求。
2>存储:将合格的文库存储在适当的条件下(如-20℃或-80℃),以待后续测序使用。
8、注意事项
1>在整个建库过程中,需要严格控制实验条件(如温度、时间、酶量等),以确保实验结果的准确性和可重复性。
2>不同的建库方法(如传统建库、转座酶法建库、扩增子建库等)在操作步骤上会有所差异,具体应根据实验需求选择合适的建库方法。
3>在使用NGS建库工作站时,应仔细阅读设备说明书和试剂操作指南,遵循实验室的安全操作规程。
从上文的操作流程可知,NGS建库工作站的具体操作步骤高度依赖于所使用的设备型号、试剂种类以及实验设计,因此在实际执行之前,深入咨询设备供应商的专业意见或广泛查阅最新的科学文献,以获取详尽且精确的操作指南,是至关重要的。这样的前置工作能够确保实验流程的顺畅进行,并最大限度地提高实验结果的准确性和可靠性。
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