ELISA检测流程详解

ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用于生物医学研究中的实验方法，广泛应用于抗体、抗原、激素、病毒等的检测。通过ELISA检测，科研人员可以获得定量或定性的分析结果，这使得它在临床诊断、疾病监测以及药物研发中有着不可替代的作用。

ELISA检测

一、包被阶段
ELISA检测的首要步骤是将待测的首要成分固定于包被板上。这一过程主要通过被动吸附实现，其效果取决于包被物质的性质。若样品中含多种抗原，则需选用具有选择性的包被板，以避免非特异性结合。然而，在间接ELISA法检测抗体时，使用纯化抗原；或在夹心ELISA法中，使用捕获抗体时，包被板已具备选择性。包被板材质多为聚苯乙烯或其衍生物，其结合特性因目标物质及检测需求而异。对于某些难以吸附的物质，如高度糖基化的蛋白质、碳水化合物等，建议使用允许共价连接的特殊处理包被板。

二、孵育阶段
试剂加入包被板后，需进行孵育，以促进结合或反应。孵育的温度和时间依据检测步骤及操作而异。通常，样品应用后于37℃孵育1小时。然而，某些步骤，如阻断，可在冰箱中过夜进行；而测定过程中的孵育则通常在室温下短时间进行。

三、洗涤阶段
洗涤是ELISA检测中至关重要的步骤，需在每次应用检测成分后进行，直至结果测定。洗涤时，通常使用磷酸盐缓冲盐水-20（PBST）作为缓冲液，以去除未结合的抗原、抗体或试剂。洗涤可手工使用多通道移液器完成，也可使用自动洗板机。洗涤不充分可能导致高背景信号，而过度洗涤则可能导致样品信号降低。洗涤的一致性对于确保板块结果的可靠性至关重要。

四、阻断阶段
在蛋白质包被ELISA板后，通常需进行阻断，以防止后续步骤中抗体的非特异性结合。阻断时，向板中加入与检测无关的混合蛋白并进行孵育，以占据非特异性结合位点。常用的阻断缓冲液包括脱脂干乳、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白。此外，非离子洗涤剂如Tween 20或Triton X-100也可作为阻断剂使用，但其阻断效果不如蛋白质持久。无效的阻断会导致背景噪音增加，降低检测的灵敏度和特异性。

五、抗体阶段
抗体是ELISA检测的关键组成部分，选择合适的抗体至关重要。单克隆抗体和多克隆抗体均可使用，各有优缺点。单克隆抗体具有高特异性，但成本较高；而多克隆抗体则能在多个结合点与目标物质结合，从而放大信号并提高灵敏度。使用二级抗体虽增加了步骤和检测时间，但可能带来灵敏度的提高。因此，在优化检测时，需找到合适的抗体对。

六、测定阶段
无论采用何种类型的ELISA检测，最后一步均为测定。最常用的测定方法是利用酶介导的可见颜色变化化学反应，随后通过紫外-可见分光光度法进行测量。酶结合抗原或抗体被添加到测试孔中，若目标物质存在，则与其结合。当加入适当底物时，酶会引发颜色变化，其程度与目标物质的数量成正比。辣根过氧化物酶（HRP）是常用的共轭物之一，通常与底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）配合使用。在HRP的作用下，TMB由蓝色变为黄色，随后加入硫酸溶液终止反应。最后，使用酶标仪在450nm波段测定每个孔的吸光度值，并根据检测设计进行校正和计算，如减去空白孔平均值、技术重复平均值或与标准比率计算。

ELISA检测是一个复杂但非常重要的实验方法，广泛应用于各类医学研究和诊断。通过对ELISA检测流程的理解和掌握，科研人员可以准确、快速地获取相关数据，为疾病的早期诊断、药物的研发等提供科学依据。

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