利用甲板上的加热器摇震模块实现SARS-CoV-2的中和抗体的自动化

摘要
检测SARS-CoV-2中和抗体的可靠血清学检测是公共卫生和临床目的的有用工具。用于检测中和抗体的酶联免疫吸附试验（ELISAs）已从FDA颁发了紧急使用授权（EUA）。除了传统的elisa抗体（如RBD）抗原偶联磁珠基elisa被固定在96孔板的表面，已经成为一种具有几个优点的替代方法。我们有开发了一种基于珠子的ELISA，用于检测SARS-CoV-2中和抗体。这种方法需要单独的仪器来执行主要步骤，如液体转移，清洗和摇晃。在OT-2平台上简化了该实验磁模块和加热器摇振器，一个协议设计和检测，以处理收集自COVID-19患者的血清样本。从ACROBio系统公司获得的RBD偶联磁珠也进行了测试并对使用相同的协议进行了比较。

主要调查结果
配备了磁性模块和加热震器模块的OT-2展示了对SARS-CoV-2进行珠状elisa的能力中和性抗体检测精度较高。
在更高的吞吐量设置中，该协议可以用最少的动手时间处理多达96个样品。

介绍
例如，在识别出病毒成分后，细胞介导的免疫反应会触发针对病毒抗原的中和抗体的分泌
存在核衣壳(N)蛋白和刺突(S)蛋白治疗严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。抗体检测可用于检测由于病毒感染而导致的血清中这些中和抗体的存在，提供解决人群或过去SARS-CoV-2感染的信息，以更好地了解SARS-CoV-2的流行病学。这些测试是在临床试验中确定疫苗效力的常用工具以及在大规模接种疫苗之后。
抗体测试通常使用酶印免疫吸附试验（ELISA），一种技术它可以检测和量化目标分子抗体)通过高度特异性的抗体-抗原相互作用。对于一个典型的夹层ELISA用于抗体检测，第一步是将SARS-CoV-2抗原附着在固体表面96孔或12孔的条纹，它们可以组装在一个与96孔酶标仪兼容的框架上。然后这些样本被添加到井中，以及抗sars-CoV-2抗体通过与抗原结合而捕获并固定。检测抗体，通常是一种能识别人IgG并携带辣根的抗体使用过氧化物酶（HRP），并在酶的底物的存在下，产生一个比色信号并且可以被测量和量化。吸光度与样品中抗sars-cov-2中和抗体的水平成正比。
或者，磁珠也可以作为elisa中的固体表面。其优点包括一个增加的在整个样品处理过程中，可用的表面积和珠子的均匀分布，可以实现更快速和灵敏的检测低分析物浓度。我们开发了一种基于珠子的ELISA，用于检测SARS-CoV-2病毒的中和抗体。该检测方法利用了SARS-CoV-2的受体结合域（RBD）S蛋白作为捕获抗原，赛默费雪herDynabeads（沃尔瑟姆，MA，USA）作为固体表面。
尽管检测设计多样，elisa通常遵循类似的工作流。一般步骤包括试剂转移、孵育和重复洗涤。基于珠的elisa程序需要单独的仪器来执行这些步骤，这可能在Opentrons OT-2平台上自动化磁性模块和加热器振动器。我们开发了一个简化检测方案，以避免多种仪器的需要，并减少实际操作时间。该方案还使用ACROBio系统公司的RBD偶轭磁珠（Newark，DE，USA）进行验证，以确认OT-2样品处理的质量。

材料和方法
在视中心OT-2上测试的ELISA示意图，完成分析的步骤大纲，以及甲板布置图（图1）
将60 μg SARS-CoV-S-2S蛋白his标记RBD结合制备RBD偶联珠（acro生物系统公司，纽瓦克，DE，美国）至5毫克迪纳比德（赛默费舍尔，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国），超顺磁性球形聚合物粒子为磁分离生物材料，然后储存在2.5 mL的封闭缓冲液中。相同的协议也是通过使用市售的RBD进行测试的吗美国生物系统的预涂层珠(36 μg RBD每毫克珠子）。人抗sars-cov-2S1抗体作为标准抗体和小鼠单克隆抗人抗体以HRP偶联作为检测抗体的IgG Fc购自细胞科学公司（纽伯里波特，MA，美国）和Abcam公司（剑桥，英国），定制的检测缓冲液分别由. 特诺瓦（霍利斯特，加利福尼亚州，美国）。
液体转移由8通道移液管进行。ELISA板被放置在磁模块上，并手动移动到加热器模块如果需要搅拌。本研究获得了以前检测为SARS-CoV-2抗体阳性或阴性的血清样本。实验完成后，立即用比色平板仪在450 nm波长下测定每个样品的吸光度。的运行时对不同样本量下的每种检测方法进行了估计（表1）。

结果
为了生成测试的标准曲线，在OT-2上，用50 μL的RBD偶联珠子悬液进行检测转移到96孔2 mL深孔板的每个孔中，预装有连续2倍稀释的人抗-SARS-CoV-2 S1抗体，检测方法见材料和方法。测量了吸光度，并进行了剂量反应曲线绘制。结果表明，OT-2进行该检测的精度（CV<10%）（图2A），并且在100 ng/mL到ng/mL之间的检测读数与抗体浓度之间存在极好的线性关联12.5 ng/mL（r平方>0.99）（图2B）。

来自宏宏生物系统的RBD预涂层珠然后重组（每mL阻断缓冲液1mg珠子），并在OT-2上使用相同的方案进行测试。制备连续2倍稀释的人抗sars-cov-2S1抗体，并暴露于20 μL面包悬液中。这些数据被用于绘制剂量-反应曲线，以供进一步分析。OT-2上样品处理的一致性（CV<10%）（图3A）和检测读数与抗体浓度的线性关系均得到了证实（100 ng/mL至6.25 ng/mL，r平方>0.99）（图3B）。

为了进行基于珠子的ELISA，以确定SARS-CoV-2 S1中和抗体的水平，该方案设计用于RBD偶联珠子的制备房子或美国生物系统公司的RBD共轭面包是用于处理之前由传统的、fda认证的ELISA检测的血清样本（阳性： *）。结果再次显示了OT-2液体处理的精度（CV <为10%）和抗体浓度根据图4所示的标准曲线得到。

对OT-2抗体的抗体中和试验

在OT-2上的基于珠子的ELISA

结论
基于珠的elisa可以在配备磁模块和的OT-2平台上成功进行加热器振动器模块。结果表明优良的样品处理质量，该方案适合处理最少的多达96个样品实际操作时间。