Bradford法

Bradford 法是一种比色法（依靠颜色变化）蛋白质定量方法。该方法的核心是 Coomassie 亮蓝 G-250 染料。这种染料在未结合状态下呈红褐色，在 465 nm波长处吸收光。然而，当它主要通过精氨酸和赖氨酸残基与蛋白质结合时，染料的颜色会变为蓝色，最大吸光度也会变为 595 nm。这种颜色和吸光度的变化与蛋白质浓度成正比，可用于定量。

需要 Bradford 法的工作流程

蛋白质纯化

在每个纯化步骤后，确定纯化蛋白的浓度对于评估产量和纯度至关重要。Bradford法提供了一种快速可靠的蛋白质定量方法，帮助研究人员判断哪些组分需要合并，并有助于评估纯化过程的效率和成功率。

细胞裂解物制备

在将裂解液用于下游应用之前，了解其蛋白质浓度至关重要。这可以确保在不同样品中使用等量的蛋白质，从而得到一致且可比较的结果。Bradford法通常用于确定这些裂解液中的总蛋白含量。

SDS-PAGE 样品制备

为了获得准确的结果，SDS-PAGE 凝胶中的每个孔都必须含有等量的蛋白质。这可确保在比较各泳道的条带时，观察到的任何差异都是由于实验条件而非负载量不均造成的。Bradford法可用于调整样品的蛋白质浓度，使每个孔中的蛋白质含量相等。

Bradford 检测方法

标准曲线法

这是最常见的方法，包括使用已知浓度的标准蛋白质（通常是牛血清白蛋白 (BSA) 或γ 球蛋白）绘制校准曲线。

1. 准备一系列标准蛋白质稀释液，以覆盖样品中蛋白质浓度的预期范围。
2. 在每个标准稀释液中加入Bradford试剂并孵育一小段时间（通常为 5-10 分钟）。
3. 使用分光光度计在 595 nm波长处测量每个标准品的吸光度。
4. 将吸光度值与已知蛋白质浓度相对照，生成标准曲线。
5. 测量未知样品的吸光度，并根据标准曲线确定其蛋白质浓度。

单点法

标准曲线法的快速替代方法。它是利用单一已知浓度的标准蛋白质来估计未知样品的蛋白质浓度。

1. 制备浓度在样品预期范围内的单一标准蛋白质。
2. 在标准样品和未知样品中加入Bradford试剂。
3. 测量标准样品和未知样品的吸光度。
4. 利用吸光度与已知标准品浓度的比值计算未知样品的蛋白质浓度。

微孔板法

该方法将 Bradford 法改良为使用微孔板进行高通量分析，可同时测定多个样品。

1. 将标准样品和未知样品移入微孔板的孔中。
2. 在每个孔中加入 Bradford 试剂。
3. 培养所需时间。
4. 使用微孔板阅读器在 595 nm波长处测量各孔的吸光度。
5. 如果在微孔板格式中使用标准曲线法，则将标准品的吸光度值与其已知浓度相对照，生成校准曲线。利用此曲线确定未知样品的蛋白质浓度。

与手动移液相比，自动化 Bradford 法的优势：

• 一致性和可重复性： 自动化可减少人为误差，使结果更加一致。
• 高通量： 自动化系统可同时处理多个样本，提高了效率。
• 降低污染风险： 自动化最大程度地降低了样本间交叉污染的几率。
• 数据记录： 自动化系统通常配有记录数据的软件，从而更容易跟踪和分析结果。