如何提高移液准确度？

简介
移液是当今生命科学实验室中最常见的活动之一。精确测量和转移从微升到毫升的极少量液体需要操作员具有良好的移液技术，使用经过校准的移液器并选择适合任何给定协议的吸头。因此，将移液视为一个系统是一种始终如一地产生准确结果的行之有效的方法。科学、培训和不断的实践表明，某些技术（例如，吸入角度、吸入和分配速率等）可以提高移液准确性。但什么是移液准确性？它是如何定义的？它是如何计算的？本文旨在通过提供简单而清晰的示例并描述“不确定性”一词及其对移液的影响，以及考虑这种不确定性的重要性，帮助任何移液器用户理解移液准确性背后的基本概念和数学。

移液精度
移液精度衡量移液器使用者提供等于或接近选定体积的液体分配量的能力。分配体积的精度取决于以下因素：

• 与移液器仪器和吸头相关的误差
• 样品中的液体类型（物理和/或化学性质）
• 用户技术
• 环境影响，例如环境温度和气压
  与移液器仪器和吸头相关的误差
  两种类型的误差会影响单个分配体积的质量：
  系统误差
  在移液术语中，系统误差 (SE) 衡量分配体积与预期体积的接近程度。
  系统误差来自仪器本身（移液器），并且对于每个分配体积都保持相同的值或比例。系统误差的示例包括使用未校准的移液器或使用非标准吸头（例如，加长）。一般而言，系统误差是可预测的，因此可以减少（例如，使用校准的移液器）。系统误差可以定性地描述为“真实度”。
  随机误差
  随机误差 (RE) 是分配体积的可重复性。在移液术语中，随机误差衡量在保持相同实验条件下，相同数量的分配体积彼此之间的接近程度。顾名思义，随机误差是不可预测的，并且对于每个分配体积而言都不相同。
  随机误差的例子包括温度波动和移液技术。随机误差可以定性地描述为“精度”。
  系统误差和随机误差如何影响整体移液精度？精度是系统误差和随机误差的组合（图 1）。

单次分配体积的不确定性
原则上，移液器用户应校正已知系统误差的测量值。对于移液而言，这意味着需要从每个分配体积中减去系统误差。此步骤不太实用。
相反，“单次分配体积的不确定性”考虑了系统误差和随机误差。
它使用以下近似方程计算，此后缩写为分配体积的不确定性：
分配体积的不确定性 (μL) = | 系统误差 | + k * 随机误差
此方程用于估计单次分配体积的不确定性，当移液器用户需要验证其移液器的性能时很有用。
在此方程中，k 是扩展因子。扩展因子也称为覆盖因子，根据定义的标准偏差值确定分配体积的置信度。例如，如果 k = 1，则分配体积的置信度为 68.3%。如果 k = 2，则置信度为 95.5%，如果 k = 3，则置信度为 99.7%。实际上，68% 的置信度从不被推荐，因为它允许“太多”错误测量（即分配量过低或过高）。另一方面，99% 的置信度太严格，几乎没有失败的余地。在科学协议中，通常接受 95% 的置信度。在移液中，95% 的置信度意味着，如果移液器用户必须在相同条件下（移液器、吸头、技术和样品）分配相同体积 20 次，则 19 次分配将在可接受的不确定性（置信范围）内，并且只有一个分配体积会被拒绝（即分配量过低或过高）。

解释移液中的不确定度
如果移液器的不确定度为 20 ± 2 µL，则意味着移液器用户确信实际分配的体积在18 至 22 µL 之间。解释移液不确定度的一种方法是用户对预期体积与分配体积的接近程度的最佳估计。

根据先前的信息，可以确定覆盖因子是置信水平的函数。以下示例说明了置信水平和重复次数在估计平均值、标准偏差和不确定度方面的影响。

移液精度示例
一旦确定了系统误差和随机误差，计算移液中的不确定度就相对简单且易于理解。
案例 1：标称量程对移液精度的影响
假设用户想要估计经过校准的 Rainin XLS+ L-20 移液器的不确定度，该移液器使用 10 次重复（即重复的单次分配量）输送 20、10和 2 µL DI 水。遵循制造商针对此特定 20 µL 移液器发布的规格：

使用不确定度方程
不确定度 (μL) = | 系统误差 (μL) | + k* 随机误差 (μL)
然后：
如果 V = 20 μL，则不确定度 = | 0.20 (μL) | + k* 0.06 (μL)
如果 V = 10 μL，则不确定度 = | 0.15 (μL) | + k* 0.05 (μL)
如果 V = 2 μL，则不确定度 = | 0.15 (μL) | + k* 0.04 (μL)
如果所需的置信水平为 95%，分配体积数为 10 (n = 10)，则覆盖率
因子 k = 2。
不确定度 (20 μL) = | 0.20 (μL) | + 2* 0.06 (μL) = 0.32 μL (1.6%)
不确定性 (10 μL) = | 0.15 (μL) | + 2* 0.05 (μL) = 0.25 μL (2.5%)
不确定性 (2 μL) = | 0.15 (μL) | + 2* 0.04 (μL) = 0.23 μL (11.5%)
这些结果表明，不确定性与标称容量有关。当我们将移​​液器操作得更接近其最大标称容量 (100% = 20 µL) 时，即使假设置信度较高，相对不确定性也会变得更小。在所给出的示例中，与移液器在 10% 标称容量附近操作时的不确定性相比，置信度为 95.45% 的 20 µL（100% 标称容量）的不确定性要小七倍。

如果用户决定降低置信度，会发生什么情况？使用相同条件但置信度为 68%，则 k = 1（再次强调，不建议将置信度降低到 68%，因为这会导致给定协议中出现“太多”失败）。
不确定性 (20 μL) = | 0.20 (μL) | + 1 * 0.06 (μL) = 0.26 μL (1.3%)
不确定性 (10 μL) = | 0.15 (μL) | + 1 * 0.05 (μL) = 0.2 μL (2%)
不确定性 (2 μL) = | 0.15 (μL) | + 1 * 0.04 (μL) = 0.19 μL (9.5%)

比较两组结果（68% 和 95% 置信度），可以确定不确定性是置信度的函数。置信度越高，不确定性越大。