使用RNAdvance Viral和OT-2平台，进行高效且高通量的SARS-CoV-2病毒RNA检测及测序研究

应用介绍
2020年新冠病毒肆虐全球，激化了人类对于临床研究目的的高通量 RNA 检测和基因测序的需求。传统手动操作方案难以提升RNA 检测的效率。在本项研究中，我们展示了在 Opentrons OT-2 自动化移液工作站上使用 Beckman Coulter Life Sciences RNAd- vance Viral 试剂盒 (C63510) 的自动化 SARS-CoV-2 RNA 提取工作流程。 我们提供的分析数据显示了通过 qRT-PCR 定量的SARS-CoV-2 检测限(LoD) 和序列比对数据，这些数据为自动测序样品和文库制备提供了依据，以便对突变株进行遗传鉴定。

RNAdvance 病毒试剂盒和 OT-2 平台概述
RNAdvance Viral kit 通过利用 SPRI 顺磁珠技术，从样品中高效提取病毒RNA。 我们在自动化的 Opentrons 平台上使用了这种试 剂，从合成鼻基质(110mM NaCl,1%w/v的猪胃I 型粘液 (Sigma M2378-100G) 和10μg/mL w/v人类基因组 DNA(Coriell NA12878), 以90%v/v 的TE/SNM) 样品中提取了不同浓度的热灭活的 SARS-CoV-2(ATCC°VR-1986HKTM) 。 每个浓度包括20 个测试样品、2个阳性对照和2个阴性对照。

工作流程吞吐量
图1显示了自动化 RNAdvance 病毒提取工作流程的 OT-2甲板布局。该工作流程从向样品裂解液中添加 Bind (BBB)开始，每个样 品仅需要消耗10个吸头，可灵活运行8个批次大小的最多96个样本。报告中描述的工作流程持续时间包括实际操作时间、样品裂解时间和优化后样品的运行时间(图2)。
使用 RNAdvance Viral试剂盒和OT-2平台，处理96个样本的工作流程总共需要3.5小时，您可以复制链接到浏览器，查看具体协议流程： https://protocols.opentrons.com/protocol/bc-rnadvance-viral。您可以根据您的需求灵活地改变方法变量，以获得您所需要的批次大小、样品输入和洗脱体积的所需结果。

该工作流程在  OT-2 上是可以全自动运行  的，每个样品使用10个吸头，并从加入Bind(BBB)    开始。实验甲板上耗材内容有：最多10个吸头架、1个 NEST 单孔储液槽、2个 NEST 12 孔储液槽、1个 NEST 0.1mL PCR板和1个 NEST  2mL 深孔板，模块包括一个磁珠纯化模块和一个温控模块，配备一个 P300 多通道移液器。所有的 NEST 耗材和模块都由 Opentrons 提供。

图2:在OT-2平台上使用RNAdvance Viral试剂盒的吞吐量情况
整个工作流程运行所需的时间包括3个部分：操作时间、裂解时间和运行时间。操作时间包括样品和OT-2的准备工作。运行时间指的是 OT-2从开始到完成整个协议所需的时间。
A)处理8个样品需要45分钟，处理96个样品需要2小时38分。
B) 图形化展示了不同样品数量下的运行处理时间。

RNAdvance 病毒试剂盒检测限制
检测限制(LoD)是用于确定OT-2平台上自动化RNAdvance Viral提取效率的指标，它表示能够在≥95%的重复测量中检测到的病毒拷贝数 的最低浓度。我们使用2019-nCoV CDC N1和RP引物和探针(2019-nCoV CDC EUA kit,Integrated DNA Technologies (IDT)) 进行探 测 ，PCR 混合液和酶使用Luna°通用探针一步RT-qPCR 试剂盒(New England BioLabs),PCR反应在PCRmax ECO48实时PCR 系统上 进行。在SARS-CoV-2 样本 (n=20) 和阳性对照样本 (n=2) 中检测到病毒RNA (拷贝数/μL), 但在阴性对照样本 (n=2) 中未检测到。根据表1的总结，分析范围内的所有对比阳性样本均被确定为阳性，其中最低浓度的病毒RNA 拷贝数为1拷贝/μL。PCR 参数如下。

表1:使用OT-2 平台和 RNAdvance Viral 试剂盒检测 SARS-CoV-2 目标 N1 的病毒灵敏度。1 copy/μL 是能够检测到≥95%样本的最低浓度，被定义为检测限制 (Limit of Detection,LoD)

为了研究 RNAdvance Viral在 OT-2 上的自动化性能，我们将850 copy/μL 浓度的热灭活 SARS-CoV-2 病毒加入合成鼻腔基质中，并提取RNA。 针对N1和RP, 确定了均值Ct值、标准差、变异系数 (CV%) 和检测率等规格参数(图3A)。
在实验样本(n=20)、 阳性对照样本(n=2) 和阴性对照样本(n=2) 中，对N1 的扩增曲线进行定量分析(图3B), 同时对包括对照样本在内的样品中的RP进行定量分析(图3C)。

DNA 测序和数据分析
为了进一步了解测序性能，我们使用Swift 2S Turbo DNA文库制备试剂盒和 Swift Unique Dual Indexing 引物板进行 N1扩增。关于850 copy/μl 样本的详细数据和序列比对结果可以在图4 中找到。我们观察到平均覆盖率为 455x, 并且平均读数有91%与参考基因组 SARS-CoV-2 分离自Wuhan-Hu-1(NC_045512.2) 对齐。读取长度与 N1扩增区域相匹配，大约为72个碱基。根据Swift 2s Turbo DNA 文库制备试剂盒制造商的说明，预期插入片段大小约为 200bp。 测序是使用 lllumina MiSeq 进行的，并将筛选数据上传至llluminaBaseSpace。在 Galaxy 中使用 Bowtie2 确定了覆盖度，并使用 Integrative Genome Viewer(IGV) 进行可视化。NC_045512.2,SAR2-COV-2, 分离源自Wuhan-Hu-1 的基因组是用于测序的NCBI参考基因组。通过在 Galaxy 中使用QualiMap-BAMQC 工具，分析了调准、读长、片段大小和CG含量等信息。

A) 综合数据 QC 表描述了多个数据点，包括455-x 的平均覆盖率和与参考基因组对齐的平均读数，SARS-CoV-2 分离株 Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2) 为91%。根据 Swift 2s Turbo DNA Library Prep 制造商的预期插入片段大小约为200bp。
B)每个样本与参考基因组对齐的对比。

总结
本研究通过 Beckman Coulter Life Sciences RNAdvance Viral 试剂盒和 Opentrons OT-2 提供了一个稳定、高性价比的自动化提取方 案。该工作流程经过优化，用于SARS-CoV-2 病毒 RNAPCR 检测，在LoD (检测限制)为每微升1个拷贝时进行了测量。我们使用了高 通量测序 (NGS) 进行测试，在平均样本覆盖度达到455 X 和平均读数对齐到 SARS-CoV-2 参考基因组的91%。该研究表明，利用 RNAdvance Viral 试剂和 Opentrons OT-2 进行样本提取可以实现高效且经济的 SARS-CoV-2 病毒 RNA 提取。同时，在测序分析方面， 该方案具有高平均覆盖度和较高的对齐率，能够为研究人员提供具有重要意义的遗传信息。这对于致力于研究SARS-CoV-2 病毒的临床研究人员来说，为他们的工作提供了一种高效、可行的样本准备方案。