使用Opentrons OT-2搭配热振荡仪进行三种ELISA自动化流程

作者
Boren Lin,PhD,Kinnari Watson,PhD

应用概述
酶免疫分析 (EIA) 或酶联免疫吸附测定 (ELISA) 是液体样本中检测目标分子(例如抗原)的常用分析工具，通常用于免疫诊断 或研究。该测定一般采用96 孔板格式，并且工作流程通常包括 试剂转移和混合，以及一些在恒定温度下的孵育和洗涤步骤。这 些步骤均要求样本处理高度一致性。为了实现自动化，我们使用 OT-2 自动化移液工作站搭配热振荡仪研发并测试了 ELISA 全自 动化的方案，该方案使用 Takara Bio 公司的夹心法 EIA 试剂盒 检测人类纤连蛋白(FN),Tecan 的竞争法 ELISA 试剂盒检测 唾液中的皮质醇，以及 Cell Sciences 的另一种竞争法 ELISA 试剂盒用于定量血清样本中的中和SARS-CoV-2 抗体。

关键发现
配备8通道移液器和热振荡仪的 OT-2 移液工作站具备高精度自动化完成 ELISA的能力。
在更高的吞吐量设置中，该协议可以用最少的操作时间处理多达96个样本。

应用介绍
酶免疫分析 (EIAs) 或酶联免疫吸附测定 (ELISAs) 是一种通过 高度特异的抗体-抗原的相互作用对液体样本的目标分子(例如 抗原)进行检测和定量的技术。这种测定通常在96孔或384孔 板上进行，我们把抗原固定在孔板上，可以通过直接将抗原连接 到固体表面或使用预涂在固体表面的捕获抗体来实现。通过这个过程，它能够将抗原与样本中其他非靶向分子分离开来。

夹心法 ELISA是该测定方法中最常用的形式。常规步骤如下：
1、如果供应商未提供预涂该抗体的孔板，我们则需要将捕获抗体(即与目标物特异结合的抗体)通过被动吸附的方式固定在孔板 上(例如，8孔或12孔条纹组装在与96孔微孔板读取器兼容的框架上)。
2、将待分析的样品加入到涂有抗体的板上，使目标抗原被捕获。
3、将固定的目标抗原暴露给与酶(例如辣根过氧化物酶或HRP)偶联的检测抗体。
4、加入酶的底物，以产生可以测量和定量的信号。

人源纤维连接蛋白(FN)EIA试剂盒 (Takara Bio,美国加利福尼 亚州圣何塞)是一种体外定量测定血清、尿液、细胞培养上清液 和其他生物液中可溶性人源 FN 的试剂盒。该试剂盒提供了足够的试剂和材料，可用于在 OT-2 平台上进行 EIA协议的设计和验证。

FN 广泛分布在细胞表面、细胞外基质和血浆中，参与细胞基质粘 附、细胞迁移、细胞形态的调控以及其他细胞功能。Takara 公司 的 FN EIA试剂盒采用两种抗人源 FN 的鼠单克隆抗体，形成抗体- 抗原-抗体夹心复合物：捕获抗体预涂在含8连管，检测抗体与过 氧化物酶结合。通过将此复合物暴露于过氧化物酶的底物中，可 以产生光度信号，其吸光度与样品中目标物(即人源 FN) 的数量成正比。

竞争法 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 通 过 检测信号干扰来测量抗原的浓度。简而言之，目标抗原与预涂在 孔板上的参照物(抗原)竞争与酶偶联抗体结合。样品中目标抗 原的浓度越高，参考抗原与抗体结合的能力就越弱，产生的信号 就越弱。 一些竞争法 ELISA 试剂盒，如次本研究中测试的 Tecan 公司的 Cortisol Saliva ELISA, 酶不是由抗体携带，而是由参照 物携带，参照物与目标抗原竞争与抗原-抗体作用。我们在 OT-2 上进行测试另一个的 ELISA 试剂是 Cell Sciences 公司(美国马 萨诸塞州纽伯里港)的 SARS-CoV-2 替代病毒中和检测试剂盒， 用于测量 SARS-CoV-2 感染后或对疫苗接种产生的循环中和抗体。中和抗体通过阻断盘状病毒融合蛋白的受体结合域 (recep-tor-binding domain,RBD) 与血管紧张素转换酶2 (angioten-sin converting enzyme 2,ACE2) 结合，抑制 SARS-CoV-2 进 入细胞。该试剂盒提供预涂的病毒棘蛋白RBD板，以竞争法ELISA 的形式，引入HRP- 偶联的ACE2 与中和抗体竞争捕获RBD。

虽然 ELISA 的设计方法有很多，但万变不离其宗，他们都遵循相似的工作流程。ELISA 的常规操作步骤包括试剂移液、孵育以及反复洗涤，这些步骤可以在 OT-2 上轻松完成。在每个试剂步骤之间会进行连续的洗涤，以去除未结合的分子。为了防止剩余的溶液带到下一个试剂步骤中，把过量的液体全部吸走非常重要。Opentrons的8通道移液器可进行高效、精准的移液处理，以满足 ELISA 中试剂移液和洗涤的需求。此外，可以通过添加 Opentrons 温控模块或热振荡仪，以提升自动化功能和满足实验中的样品孵育环节(例如设定为37℃以促进抗原-抗体相互作用)所需的恒温功能。

材料和方法
图1-3显示了在 Opentrons OT-2 上测试的三种 ELISA 的示意图，包括试验步骤概述和甲板布局。

液体转移是通过8通道移液器进行的。ELISA 孔板使用了一个带 有裂缝密封的封膜 (BioChromato, 日本藤泽),这样移液器 的吸头可以穿过封膜，同时在孵育期间防止蒸发。然后，ELISA 板被固定在热振荡仪上，并按照说明书的要求提供热力和搅拌 作用(参考表1)。在完成实验后，需要立即手动将 ELISA 孔板移至酶标仪，并在450 nm 波长处测量吸光度值。

为了测试 FN EIA 试剂盒，首先将人血浆中的 FN 溶解在去离子水中，制备出1 mg/mL 的储备溶液，然后进一步稀释至500 ng/mL 并进行2倍的连续稀释。而对于皮质醇 ELISA 测试，则 使用试剂盒提供的已知皮质醇浓度的标准品和控制液。之前已 经测试过 SARS-CoV-2 抗体阳性或阴性的血清样本将被用于病 毒中和 ELISA 实验。每个实验在不同样本量下的运行时间是可预估的(参考表1)。

实验结果
将 FN EIAs 在 OT-2 上进行处理。可以通过评估最终读数与目标分子浓度之间的相关性以及不同实验之间这种相关性的一致性来评估样本处理质量。通过绘制平均吸光度 (n=3)与 FN 浓度之间的关系图，并计算标准偏差，可以确定线性回归的拟合优度。

结果展现了 OT-2 在执行该试剂盒的实验中的准确性和精密度(R平方>0.99,CV<10%) (图4A), 和重复性(图4B)。使用皮质醇的连续稀释来测试OT-2上的竞争法 ELISA 。结果显示液体处理的一致性 (n=3,CV<10%),在半对数图上呈现了试验读数与对数转换后的样品浓度之间的优秀负线性关联 (R 平方>0 .99) ( 图5A), 并且实验之间具有可重复性(图5C)。

为了检测竞争法 ELISA 中 ACE2-RBD 结合的抑制作用，血清样本 在 OT-2 上进行了三次处理，在酶标仪上测量吸光度，并获得了变异系数。结果再次确认了 OT-2 液体处理的精确性 (CV<10%)(图6)。根据厂家的说明书，该实验是有效的，因为每个控制组 的 OD450 值都在标准范围内(阳性对照<0.3,阴性对照>0.9)。抑制率的计算公式如下：

该实验成功检测到先前被诊断为SARS-CoV-2抗体阳性的样本中能够中和 ACE2-RBD 相互作用的抗体(表格1)。

实验总结
通过使用 OT-2 进行竞争性 ELISA和中和抗体检测，我们得出结论：
1、在 OT-2 上进行的稀释处理和吸光度测量显示了高度一致的结果，证实了 OT-2 液体处理的精确性和可重复性。
2、根据厂家说明书的要求，实验的对照组的 OD450 值都在有效范围内，验证了实验的有效性。
3、利用实验测量的抑制率，成功检测到先前被诊断为SARS-CoV-2 抗体阳性的样本中存在的中和抗体。
4、表格2中的人体血清样本确认为阳性，进一步证实了其先前 ELISA检测的结果。
综上所述，该实验在检测中和抗体方面表现出优越的精确性和可靠性 ，OT-2 的样品处理能力足以与传统手动方法相媲美。