两种用于 SARS-CoV-2 检测的自动化低成本 RNA 提取方案的评估

背景

已经评估了两种用于从鼻咽拭子中高通量提取 RNA 以检测 SARS-CoV-2 的自动化内部协议。

方法

在 10 天内收集了 141 个 SARS-CoV-2 阳性样本。内部协议基于磁珠提取，设计用于 Opentrons OT-2（OT-2_内部）液体处理机器人或 MagMAX ^TM Express-96 系统（MM_{内部）。两种协议均与使用 MagMAX} ^TM系统（MM_试剂盒）的商业试剂盒并行测试。核酸提取效率是根据 SARS-CoV-2 DNA 阳性对照计算的。

结果

在检测阳性样本方面，内部方案和商用试剂盒之间没有发现显著差异。MM 试剂_盒效率最高，尽管_{内部 MM 试剂盒}的平均 Ct 值低于其他两种试剂盒。与商用试剂盒相比，内部方案每提取 96 个样本可节省 350 欧元至 400 欧元。

结论

所述协议利用易于获得的试剂和开源液体处理系统，适用于高通量设施中的 SARS-CoV-2 检测。

引用： Lázaro-Perona F、Rodriguez-Antolín C、Alguacil-Guillén M、Gutiérrez-Arroyo A、Mingorance J、García-Rodriguez J 等人。 （2021）评估两种用于 SARS-CoV-2 检测的自动化低成本 RNA 提取方案。 PLoS ONE 16(2): e0246302。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246302

编辑： AM Abd El-Aty，埃及开罗大学

收稿日期： 2020 年 11 月 5 日；接受日期： 2021 年 1 月 15 日；发表日期： 2021 年 2 月 16 日

版权所有： © 2021 Lázaro-Perona 等人。这是一篇开放获取的文章，根据知识共享署名许可条款分发，允许在任何媒体中不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和出处。

数据可用性：所有相关数据均在论文及其支持信息文件中。

资金：作者未收到此项工作的特定资金资助。

竞争利益：作者已声明不存在竞争利益。

介绍

SARS-CoV-2 疫情要求大规模使用 qPCR 检测，以发现阳性病例并追踪接触者，从而阻止社区传播。在 qPCR 检测之前，通常需要对临床样本进行 RNA 提取 [ 1-4 ]。考虑到每天检测的样本数量，大多数机构无法采用手动 RNA 提取方法，因此，自动化系统被广泛用于此任务 [ 5-7 ] 。自动化系统的缺点是，它显著增加了最终成本，这可能会阻碍某些地区的大规模检测。此外，由于需求增加，提取试剂的库存短缺导致诊断严重延迟。

本文介绍了两种低成本的自动 RNA 提取方法。第一种方法使用 OT-2 系统（Opentrons，纽约州纽约市，美国），这是一种能够自动执行自行设计方案的开源液体处理机器人；第二种方法使用快速且易于使用的核酸提取仪 MagMAX ^TM Express-96 系统（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国）。后者可在 30 分钟内提取多达 96 个样本，但需要事先手动分配试剂、磁珠和 96 孔板中的样本，这会增加 30 分钟。作为替代方案，OT-2_内部方案可以完全自动化地在 104 分钟内处理多达 48 个样本。

方法

样品采集

在十天内，收集了 141 份连续的 SARS-CoV-2 阳性鼻咽拭子，这些拭子带有病毒运输培养基（西班牙巴塞罗那 Deltalab），并储存在 4°C 下。处理前，将 500 μL 病毒培养基和 500 μL 4M 异硫氰酸胍 (GTC)（德国希尔登 Qiagen）与 5 μg/mL 载体 RNA 混合，使样品失活，然后将样品在 80°C 下加热 2 分钟，并短暂涡旋混合。

设备和试剂

核酸自动提取采用两种系统：MagMAX ^TM Express-96 深孔磁粉处理器（King Fisher Instrument，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和开放式系统 OT-2（Opentrons，美国纽约州纽约），配有 GEN1 磁模块（Opentrons，美国纽约州纽约）和内部协议。两种系统均使用 MagMAX™ Express 96 板和深孔板（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。

核酸提取采用三种方法：1）根据制造商的说明，使用 MagMAX ^TM和商用 MagMAX CORE 核酸纯化试剂盒 (MM_{试剂盒)（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）；2）OT-2 系统采用通用试剂（OT-2内部}），例如乙醇（Emsure®，Merck KGaA，德国达姆施塔特）、2-丙醇（Emsure®，Merck KGaA，德国达姆施塔特）、洗脱缓冲液（Omega BIO-TEK，美国佐治亚州诺克罗斯）、无核酸酶水（Ambion ^TM，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和磁珠（Mag-Bind® TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美国佐治亚州诺克罗斯）；3）MagMAX ^TM采用与商用试剂盒相同的协议，但使用 OT-2 方法中的试剂（MM_内部）。内部协议是 Hui He 等人描述的程序的修改版[8]。简而言之，将灭活的呼吸道样本以 1:1 的比例与异丙醇混合，至最终体积为 500 μl（_{内部OT-2）和 1000 μL（内部}MM），加入 40 μL 磁珠并在室温下孵育 5 分钟。接下来，用磁铁将磁珠拉到管的一侧并弃去上清液。然后用 500 μL 新鲜制备的 70% 乙醇洗涤磁珠两次。第二次洗涤后，弃去 70% 乙醇并在室温下风干磁珠。最后，将珠子重新悬浮在 100 μL 洗脱缓冲液中并再次用磁铁分离以回收洗脱的病毒 RNA（表1）。

表 1.所评估的三个方案中使用的步骤、试剂和体积（μL）。

协议设计和验证

MM_试剂盒协议：

1. 准备两个深孔板，一个深孔板每孔装有 500μL MagMAX™ CORE Wash Solution 1，另一个深孔板每孔装有 500μL MagMAX™ CORE Wash Solution 2。准备一个 MagMAX™ Express 96 微量滴定板，每个孔装有 90μL MagMAX™ CORE Elution Buffer。
2. 每个样品准备 20μL MagMAX™ CORE 磁珠和 10μL MagMAX™ CORE 蛋白酶 K 的混合物（珠子/PK 混合物）。
3. 为每个样品准备 300μL MagMAX™ CORE 裂解溶液和 300μL MagMAX™ CORE 结合溶液的混合物（裂解/结合溶液）。
4. 在深孔板中每孔分配 30μL 珠子/PK 混合物、700μL 裂解/结合溶液和 200μL 样品。
5. 将所有板放入系统并运行脚本 MagMAX_CORE_KF-96。

MM_内部协议：

1. 准备两个深孔板，每个孔加入 500μL 70% 乙醇。准备一个 MagMAX™ Express 96 微量滴定板，每个孔加入 90μL 洗脱缓冲液（Omega BIO-TEK，美国佐治亚州诺克罗斯）。
2. 在深孔板中每孔分配 40 μL 磁珠（Mag-Bind® TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美国佐治亚州诺克罗斯）、500 μL 异丙醇和 500 μL 样品。
3. 将所有板放入系统并运行脚本 MagMAX_CORE_KF-96。

OT-2_内部协议：

1. 将 40μL 磁珠（Mag-Bind® TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美国佐治亚州诺克罗斯）、250μL 异丙醇和 250μL 样品分装到深孔板中。用移液器吹打五次混匀，室温下孵育 5 分钟。
2. 激活GEN1磁性模块4分钟。
3. 收集上清液并弃去。
4. 加入500μL 70%乙醇，收集并丢弃。
5. 加入500μL 70%乙醇，收集并丢弃。
6. 风干 4 分钟。
7. 关闭GEN1磁性模块并添加100μL洗脱缓冲液（Omega BIO-TEK，美国佐治亚州诺克罗斯）。
8. 30秒后打开GEN1磁性模块。
9. 90秒后收集上清液并转移至96孔微量滴定板。

样品输入量是自动移液系统允许的最大量，其他试剂的量也不同，因此三种方法的输入量不同

OT-2内部协议是根据 Opentrons 说明用 Python 编写的。脚本已存放在 GitHub 存储库中

为了验证内部核酸提取方案的性能，使用 DNA 阳性对照 TaqMan 2019-nCoV 对照试剂盒 v1（赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）制作了标准、低和极低病毒载量的模拟样本。对照试剂盒的浓度为 1 x 10 ⁴拷贝/μL。标准病毒载量样本的制备方法是将 10 μL 阳性对照与 490 μL 病毒运输培养基和 500 μL GTC 混合。低和极低病毒载量的制备方式相同，但使用阳性对照的十倍连续稀释液。所有模拟样本均制备三份，并与_内部OT-2 、MM_{试剂盒和内部}MM并行处理，然后使用 TaqMan 2019-nCoV 检测试剂盒 v1 进行 qPCR 测试。标准、低和极低病毒载量的模拟样本中阳性对照的最终浓度分别为 1 x 10 ⁶拷贝/mL、1 x 10 ⁵拷贝/mL 和 1 x 10 ⁴拷贝/mL。所有运行均包括阴性对照。

通过将模拟样本中阳性对照的 Ct 值 (Ct _ss ) 与直接从库存制备的阳性对照的 Ct 值进行比较来计算核酸提取效率，校正量以匹配稀释因子和每个方案中使用的初始样本量 (Ct _pc ) (R = 2 ^-ΔCt = 2 ^-(Ctss-Ctpc) )。

定量PCR

使用针对orf1ab、刺突 (S)、核衣壳 (N) 和人 RNaseP 基因的 TaqMan 2019-nCoV 检测试剂盒 v1 以及作为阳性对照的 TaqMan 2019-nCoV 对照试剂盒 v1，按照制造商推荐的 qPCR 条件对 SARS-CoV-2 病毒 RNA 进行核酸扩增。所有 qPCR 检测均在 CFX96 Touch 实时 PCR 检测系统 (Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯) 中进行。为了减少检测间差异，提取的核酸样本使用另一个 OT-2 模块自动分配到 qPCR 试纸中。

统计分析

成对比较了这三种方案。使用 McNemar 检验来比较它们将样本分配为阳性或阴性的表现。Ct 值不呈正态分布，因此使用 Wilcoxon 符号秩检验来比较每个目标的 Ct 值。对于每个目标，仅考虑通过这三种方法扩增的样本。使用 bootstrap 方法计算中位置信区间。

所有统计测试均采用 IBM SPSS Statistics 24.0.0.0 软件包（SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）执行。

结果

提取方案的效率

通过提取用模拟不同病毒载量的 SARS-CoV-2 阳性对照制备的模拟样本，将两种内部方案的核酸提取效率与 MM_{试剂盒方案进行了比较。MM试剂盒}和 OT-2_内部方案成功扩增了所有具有标准病毒载量的模拟样本中的orf1ab、S 和 N 靶标。对于这些样本，所有重复和基因的平均提取效率为 MM_{试剂盒33.9%（SD：13.8），OT-2内部}方案19.6%（SD：2.2），MM_内部方案16.0%（SD：5.03） 。

在低病毒载量模拟样本中，MM_试剂盒无法扩增所有样本中的 S 靶标，也无法扩增其中一个重复样本中的 N 靶标，而 OT-2_内部和 MM_内部检测出了所有基因。最后，MM_试剂盒和 OT-2_内部方案无法扩增极低病毒载量样本，除了一个重复样本，其中 N 基因可以通过 OT-2_内部方案扩增，但 MM_内部可以检测到所有样本中的阳性对照，其中一个样本含有三个靶标，一个样本含有 orf1ab和N 靶标，最后一个样本含有orf1ab靶标（S1 表）。

临床呼吸道样本的核酸提取

收集的 141 份阳性临床样本同时使用 MM_试剂盒、OT-2_内部方法和 MM_内部方法进行核酸提取，并通过 qPCR 检测洗脱的 SARS-CoV-2 RNA。记录每个目标的阳性/阴性结果和扩增循环阈值 (Ct)。根据制造商的说明，当三个目标区域中至少一个扩增且 Ct<40 时，样本被视为阳性。所有运行中包括的阴性对照在所有情况下均产生阴性 PCR 结果。

141 个样本中，123 个样本通过至少一种提取方法检测出 SARS-CoV-2 阳性，而 18 个样本通过三种方法检测均为阴性。这可能是由于样本在采集期间降解所致，因为它们已在 4°C 下储存了约 48 小时 [9]。按方法分类，114 个样本使用 MM_{试剂盒检测呈阳性，111 个样本使用内部}OT-2 检测呈阳性，118 个样本使用_内部MM 检测呈阳性。成对比较发现它们检测 SARS-CoV-2 的性能没有显著差异（MM_试剂盒Vs OT-2_内部，P = 0.5465；MM_试剂盒Vs MM_内部，P = 0.3865；OT-2_内部Vs MM_内部，P = 0.0961）。18 个样本通过三种方法中的一些方法检测呈阴性。这些具有较高的 Ct 值， orf1ab和 N 靶标的中值分别为 38.68 和 38.19（在这些样本中，S 靶标未通过任何方法扩增）。比较所有方法和靶标的成对线性回归和相关性分析显示 R ²值在 0.85 和 0.95 之间，Bland-Altman 分析表明在整个 Ct 范围内一致性是一致的（S1 图）。

_{在使用 MM试剂盒}提取的样本中，43% 可检测到三个靶标（orf1ab 、 N 和 S ），在使用_内部OT-2 提取的样本中，49%可检测到，_{在使用内部}MM 提取的样本中，49% 可检测到（图 1）。在 34%、39% 和 30% 的样本中检测到了orf1ab和 N 靶标，在 19%、10% 和 17% 的样本中仅扩增了 N 靶标。只有极少数样本因单独扩增orf1ab靶标（6）、orf1ab + S（1）或 N + S（5）靶标而被视为阳性，并且没有样本以 S 基因作为唯一的阳性标记。事实上，该检测中的 S 靶标明显缺乏灵敏度，并且与诊断决策无关。使用 OT-2_内部协议检测到两个或三个目标的样本占 87%（97 个样本），使用 MM_{内部协议检测到两个或三个目标的样本占 82%（95 个样本），使用 MM试剂盒}检测到两个或三个目标的样本占 79% （90 个样本）。

考虑配对样本时，在 orf1ab ( P = 0.437)、N ( P = 0.686) 和 S ( P = 0.794) 靶标的 Ct 值中，MM 试剂盒和 OT-2 内部方案之间的 Cts 没有显著差异( 图 2 )。与 MM 试剂盒 ( orf1ab ; P < 0.00001 , N ; _P < _0.00001 , S ; P = 0.00148 )和OT - 2内部_方案( orf1ab ; P < 0.00001, N; P = 0.00008, S; P = 0.00252)相比，MM_{内部方案在所有靶标中的 Cts 确实显}著较低。

图 2.箱线图显示使用 MM_试剂盒、OT-2_内部方法和 MM_{内部方法获得的}orf1ab 、S 和 N 目标的 Ct 值分布。y 轴显示扩增循环 (Ct)。显示每个数据集上的数据点数量。

使用 MM_试剂盒、OT-2_{内部试剂盒}和 MM_{内部试剂盒对}orf1ab靶标的中位扩增循环 (CI:95%)分别为 35.53 (33.82–36.36)、35.58 (34.33–36.21) 和 34.8 (33.71–35.29)。对于 S 基因，中位扩增循环 (CI:95%) 为 30.16 (28.56–33.08)、31.32 (29.22–32.88) 和 31.07 (29.36–32.90)；对于 N 靶标，中位扩增循环 (CI:95%) 为 34.83 (33.93–35.97)、34.64 (33.42–35.29) 和 34.28 (33.52–35.10)。

开采成本和实际操作时间

_{使用 OT-2内部}协议提取 96 个样本的核酸，总成本为 107 欧元（试剂 37 欧元和实验室器具 70 欧元），实际操作时间为 10 分钟，提取时间为 3 个半小时（脚本每次运行处理 48 个样本，因此必须完成两次）。MM_内部成本为 66 欧元（试剂 37 欧元和实验室器具 29 欧元），MM 试剂_盒成本为 472 欧元（试剂 443 欧元和实验室器具 29 欧元）。两种协议的实际操作时间均为 40 分钟，提取时间均为 30 分钟。值得注意的是，虽然 96 个样本的 OT-2 协议比 MM_内部协议贵 40 欧元，但所需的初始投资明显较低，OT-2 系统（包括模块和移液器）约为 10,000 欧元，MagMAX ^TM系统约为 50,000 欧元。

讨论

本文介绍了两种低成本病毒 RNA 提取和临床样本 SARS-CoV-2 检测方法，其性能与商用试剂盒相当。尽管内部方案提取 DNA 对照的效率低于商用试剂盒，但在临床样本中，整体灵敏度并未受到影响，这可能是因为内部方案使用更大的样本起始量来弥补较低的效率。

设置 OT-2 系统进行 RNA 提取需要对没有经验的团队进行密集编程，但提供了一种经济高效的替代方案，能够在一次运行中提取 48 个样本。这项工作中使用的脚本已上传到开放访问软件存储库 GitHub，在那里可以找到许多用于这些和类似应用程序的协议。这应该有助于其他工作人员避免或减少编程步骤。该协议几乎不需要动手时间，并且使用容易获得的试剂。此外，与其他提取系统相比，该设备所需的投资较低，使其适用于中低资源设施。MagMAX ^TM Express-96 是一种快速、半自动设备，每次运行能够提取 96 个样本。MM_试剂盒提供用于灭活、裂解、洗涤和洗脱的试剂，可以以具有竞争力的成本用于不同的基质和样品类型。另一方面，MM_内部协议利用该系统的半开放方法，用其他化学品替代商业解决方案，使其更具成本效益。在这两种情况下，都必须手动准备深孔板、缓冲液和样品，这会增加总提取时间和操作错误风险。这两种内部协议的主要缺点是，当处理粘稠样品时，粘液、高粘性多糖、白细胞、红细胞、血红蛋白、蛋白酶和含有大量细胞核酸的细胞碎屑会阻碍 RNA 提取或抑制 PCR 反应 [ 10-12 ] 。为了部分克服这个问题，可以在提取前对样品进行加热和涡旋或离心，但这会增加动手时间和响应时间。当使用_内部MM时，洗脱样品在某些情况下可能含有痕量的磁珠，但这不会影响 RT-PCR 反应的性能。

在这三个系统中，阴性对照在所有情况下均为阴性，表明在这些系统中处理原始样本时不存在交叉污染问题。不过，与非自动化系统一样，应采取预防措施，将 PCR 前和 PCR 后操作分开。如果使用 OT-2 模块设置 PCR 后反应（例如测序），则不应使用它从样本中提取核酸，除非彻底净化。

研究优势和局限性

这项研究的主要优势在于，这些方法都是在临床微生物实验室中用真实样本进行测试的。方法之间的比较并不系统，这是一个重要的限制。事实上，设计的目的是优化每个系统的结果，因此输入是不同的。系统地探索输入样本量以及其他试剂量将是有益和有益的，但这超出了这项研究的目的，即比较临床实验室环境中系统与真实样本的性能。

结论

总之，这里介绍的两种内部核酸提取方法可有效实现 SARS-CoV-2 的高通量诊断，且成本仅为其他商业试剂盒的一小部分，且不损失灵敏度。