利用OT-2上的®DNA制备试剂盒自动制备小基因组的DNA文库

作者
马修·阿卡纳，金纳里·沃森博士，莫拉约·阿德伊比博士。

介绍
下一代测序（NGS）的工作流程包括使用市售软件制备DNA文库以及经济有效的DNA制备试剂盒。通过使用自动化的OT-2协议来优化这个工作流很有帮助以提高DNA文库的制备效率。
在这里，我们描述了伊利®DNA的效率。准备工具包(Illumina，CatNo。20018705)在OT-2，机器人液体处理平台上，自动执行标记工作流程。使用OT-2的高性能能力自动化此过程提供了一个快速和健壮的工作流程，生成用于基因组测序的统一DNA准备文库。

照明®DNA准备试剂盒和外中心OT-2平台概述
伊利®专利NGS标记工作流程实现了利用珠子进行的珠上标记链接的转座体。珠链的化学性质转座体对DNA片段化更有效和DNA末端修复与之前的溶液内标记工作流程相比。该DNA片段使用双索引适配器进行标记，这是一种独特的条形码分配每个DNA片段。DNA Prep样本（n=8）分别为量化，归一化到一个4nM的库，汇集到一个单个多路复（8倍或16倍）样品，然后在Illumina®MiSeq上的2x75流细胞上进行基因组测序。我们的数据显示了所有数据的低可变性，PNA扩增前后测定的DNA制备样本；条形码平衡，以及统一和高覆盖率的测序比对。参考基因组的研究表明，使用OT-2协议的自动标记为基因组测序提供了一个高质量的DNA准备文库。

OT-2工作流协议的原理图
DNA和IDT®对®DNA/RNA UD指数集A的DNA和IDT®。20027213)在孵育期间一个被称为标记的过程，在OT-2上，如图（图1）所示。进行了标记清洗步骤，以去除残留的DNA和适配器。下一个的用OT-2方法进行DNA扩增具有可编程盖和块温度的甲板上热循环器。

按照OT-2方案，进行后扩增
使用AMPure(贝克曼库尔特，猫。不a63881)根据制造商进行检测推荐DNA Prep样本被定量，归一化至4nM(使用NEBNext®文库定量试剂盒对伊利®文库定量进行qPCR测定试剂盒，以8倍或16倍的形式汇集成单个样本，然后在伊利®MiSeq上的2x75流池上运行。根据伊利®DNA/RNA独特双（UD）索引适配器条形码序列，提取测序数据并进行解复用。与参考基因组和覆盖图谱对齐的序列是通过真真品2021.2.2

工作流布局
OT-2平台的布局包括模块，实验室软件，和伊利米纳®DNA准备试剂，如详见（图2）。虽然该工作流包括：在OT-2上进行自动移液，人工干预是需要在甲板上的之间移动样品板热循环笔和磁块，并在协议期间重置移液管尖端架。

DNA制备样本的PCR扩增
采用伊利®DNA制备试剂盒构建OT-2上的Lambda DNA文库（n=8,100 ng）。分别定量前后PCR浓度（ng/uL）5个周期的PCR扩增，和DNA浓度使用Quant-iT™dsDNA高灵敏度检测试剂盒(热费雪科学公司，Cat。No.Q33120)在一个Qubit®上确定变异系数，即标准差除以整个样本的平均值。Lambda DNA样本的PCR前平均浓度为2.92，变异系数（CV）为10.4%，5个周期后的PCR后浓度平均为28.23，CV为10.7%，见（表1）。这些结果很简单，优化后的OT-2协议可以产生一个高质量和可靠的NGS DNA准备库。

DNA制备文库的小基因组测序
对96个样本的®DNA制备试剂盒(M)进行标记。用No. 20018705)制备了大肠杆菌非甲基化基因组DNA (Zymogen，Cat。. 不. 样品（n=16,100ng）

这个工作流在OT-2上都有自动的移液功能，需要手动操作在甲板上移动样品板(1)和磁性磁块(2)，以及复位在运行期间的尖端机架。甲板布局包括1个NEST 12井水库，1个96井铝块，1倍埃彭多夫热循环器上的200ul PCR板，和一个1xNEST0.1 mL PCR板上温度模块(3)。模块包括一个磁性模块、温度模块、热循环器模块，以及P20和P300多通道移液管。

两批，第二批，E。. 大肠杆菌DNA样本
（n=8,100 ng）在OT-2上的2个单独的列上进行处理，以解释列内可能出现的可变性。
E. 大肠杆菌DNA（n=16,100 ng）和Lambda DNA (n=8,100ng)被扩增、归一化，并汇集到一个单一的多路复用（8倍或16倍）样本中进行测序。
对三个DNA制备批次的测序结果为比较确定样品产量，条形码
. 平衡和覆盖率，如（表2）所示，对DNA制备文库观察到统一的产量。计算了E的样本产量。8号试验室的大肠杆菌含量分别为9.75和3.79
. 16倍；8倍和16倍®适配器条码的CV值分别为8.77%和6.2%，显示8倍和16倍样本的平衡是准确的8倍的平均11.2%-12.31%，相比之下，预期的为12.5%。对于16-plex，根据伊利®参考计算的6%的期望值为6.2%。DNA的平均基因组覆盖率准备了E。大肠杆菌样本的8倍为150倍，16倍为45倍
. 此外，Lambda 48kb基因组的覆盖图谱显示~为7800倍，这表明对齐的序列reads水平较高（图3）。总的来说，这表明在OT-2上构建的用于测序的DNA Prep文库与参考计算相比显示出一致性（图4）。

结论
我们演示了它的高性能和性能。在视中心OT-2上使用伊利umina®DNA准备试剂盒自动标记过程。我们展示了DNA Prep样本显示出低变异性，条形码平衡性，以及序列比对的高覆盖率。自动化这个全面的NGS工作流在的上OT-2将DNA文库制备过程中的风险降至最低，同时确保基因组的DNA文库制备质量先后顺序