基因二代测序原理是什么

随着科技的飞速发展，基因测序技术已经历了从一代到二代的巨大飞跃。基因二代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）是一种革命性的技术，能够在短时间内快速、准确地测定大量DNA序列。极大地提高了测序的效率和准确性，还极大地降低了测序的成本，使得大规模基因组测序成为可能。

基因二代测序原理是什么

一、边合成边测序
在DNA复制过程中，随着DNA聚合酶沿模板链移动，新合成的DNA链上会不断添加新的碱基。基因二代测序技术正是在这一过程中捕捉新添加的碱基信息，从而确定DNA的序列。具体来说，测序过程中会同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异性荧光标记的4种dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）。这些dNTPs的3'-OH端被化学方法保护，因此每次只能添加一个dNTP。当一个dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉，随后加入激发荧光所需要的缓冲液，激发荧光信号。最后，利用计算机分析将光信号转化为测序碱基。

二、可逆终止末端
基因二代测序技术使用了特殊的可逆终止剂。当DNA聚合酶将其掺入到新合成的DNA链中时，会形成一个可逆的终止末端。这个终止末端会暂时阻止DNA聚合酶继续添加下一个碱基，从而使得每次只能添加一个碱基并进行荧光信号的捕捉。随后，通过加入特定的化学试剂，可以切除这个可逆终止末端，暴露出3'-OH端，以便进行下一个碱基的添加和测序。

三、测序平台与原理实例
以Illumina测序平台为例，其测序原理基于边合成边测序技术。在测序过程中，DNA片段通过适配子连接到流动槽（flow cell）上，经过PCR扩增后形成簇群。然后，通过逐轮加入带有荧光标记的可逆末端终止子碱基，每次加入一个碱基并检测发出的荧光信号，逐步合成新链，从而读取DNA序列。具体来说：
1、DNA文库构建：将DNA样本切割成短片段，并添加接头进行修饰，以便进行后续的测序反应。
2、上机测序：将构建好的DNA文库加载到测序仪上，进行桥式PCR扩增，形成簇状结构，增强荧光信号强度。
3、边合成边测序：在测序过程中，逐轮加入带有荧光标记的可逆末端终止子碱基，每次加入一个碱基后，利用激光扫描捕捉荧光信号，并确定添加的碱基类型。随后，切除可逆终止末端，继续下一个碱基的添加和测序。

四、技术特点与应用
基因二代测序技术具有高通量、高效率、低成本等优点，可以同时对大量DNA分子进行测序，适用于基因组学研究、转录组学研究、疾病诊断与治疗等多个领域。例如，在基因组学研究中，可以利用二代测序技术快速获取大量个体的基因组信息，揭示人类遗传多样性、疾病易感基因等关键信息；在疾病诊断中，可以通过检测患者样本中的基因突变、融合基因等信息，为精准医疗提供有力支持。

基因二代测序原理主要基于边合成边测序和可逆终止末端技术，通过捕捉新添加的碱基信息来确定DNA的序列。这一技术具有诸多优点和广泛的应用前景，在生命科学研究和临床应用中发挥着重要作用。

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