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应用笔记 | 基于 Opentrons Flex 的自动化蛋白质酶解与纯化
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应用笔记 | 基于 Opentrons Flex 的自动化蛋白质浓度定量与均一化处理
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样品中目标蛋白的纯化与鉴定是蛋白质组学研究的基石。蛋白质分离后,总蛋白的浓度定量与均一化处理可为后续液相色谱-质谱(LC-MS)分析的样品酶解及纯化步骤建立基准(图1)。使用自动化设备完成这些必要步骤中的重复移液操作,可显著提升实验通量并为研究人员节省宝贵时间。本研究作为自下而上蛋白质组学完整工作流程的关键环节,采用 Opentrons Flex 自动化移液工作站的两套流程,实现了已纯化的单克隆抗体的自动化定量与均一化处理。
图 1. Opentrons Flex 自动化样品制备工作流程示意图。
Opentrons Flex 自动化移液工作站
1 实验方法
使用两个公开的运行程序自动执行单克隆抗体样品的定量和均一化(图2)。将从三种细胞培养物中收集的纯化单克隆抗体(六个复孔)、两倍稀释的 BSA 标准品以及 BCA 试剂(Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)手动加载到 Opentrons Flex 平台上。工作站执行了 BCA 工作液的制备以及工作液与样品或标准品的混合(每个反应200 µL工作液 + 25 µL样 品/标准品),随后在热振荡模块上进行短暂振荡并在37°C孵育30分钟。然后通过板式吸光度读数器模块在562 nm处测量吸光度。生成标准曲线并估算三种纯化单克隆抗体的浓度(图3)。
蛋白质浓度定量与均一化处理 - 第一部分:
Pierce BCA 蛋白浓度检测
图 2.Opentrons Flex 自动化蛋白质定量和均一化的甲板布局示意图。
板位 C2 - Corning 96 孔平底板 360 µL或类似耗材
板位 D2 - Corning 96 孔平底板 360 µL或类似耗材的板盖
板位 D1 - 热振荡模块(搭配通用平底适配器)
板位 C1 - Opentrons 24 孔离心管架(搭配 NEST 1.5 mL 离心管,最多 24 个样品)或 NEST 96 孔深孔板(2 mL)
板位 B1 - Opentrons 24 孔离心管架(搭配 NEST 1.5 mL 离心管)(若样本数 > 24)
板位 A1 - Opentrons 24 孔离心管架(搭配 NEST 1.5 mL 离心管)或 Opentrons Tough 96 孔全裙边PCR板(200 µL)或 NEST 96 孔深孔板(2 mL)
板位 A2 - Opentrons 10 孔离心管架(搭配 NEST 4×50 mL 及 6×15 mL 离心管)
板位 C3 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒(50 µL)
板位 B3 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒(1000 µL)
板位 D3 – 板式吸光度读数器模块
蛋白质浓度定量与均一化处理 - 第二部分:
均一化样本制备
板位 C2 - Opentrons Tough 96 孔全裙边PCR板(200 µL)
板位 C1 - Opentrons 24 孔离心管架(搭配 NEST 1.5 mL 离心管(最多 24 个样品) 或 NEST 96 孔深孔板(2 mL)
板位 B1 - Opentrons 24 孔离心管架(搭配 NEST 1.5 mL 离心管)(若样本数 > 24)
板位 A2 - Opentrons 10 孔离心管架(搭配 NEST 4×50 mL 及 6×15 mL 离心管)
板位 C3 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒(50 µL)
板位 B3 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒(200 µL)
Figure 3.通过BCA法蛋白浓度检测估算纯化产物中的IgG浓度。
实验首先采用牛血清白蛋白(BSA)在PBS或洗脱缓冲液中进行连续两倍梯度稀释(左图,起始浓度:2000 μg/mL, n=4)以建立标准曲线,随后将各样本的吸光度值拟合至该标准曲线(右图,n=6)
均一化流程计算了样本与稀释液(100 mM碳酸氢铵)所需体积,并通过移液制备含有均一浓度单克隆抗体(100 ng/µL)的新微孔板。
结论
Opentrons Flex 自动化移液工作站及其公开的实验方案,能够自动化完成蛋白质定量(如 BCA 检测)与均一化处理,从而将目标蛋白稀释至所需浓度。该自动化方法为常规实验任务提供了便捷的解决方案,既有助于减少人力需求,也能将其整合到基于 LC-MS 的蛋白质组学分析工作流程中。
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