应用笔记 | 基于 Opentrons Flex 的自动化蛋白质酶解与纯化

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）是表征蛋白质组的关键工具。然而，其工作流程（包括将蛋白质酶解为肽段、通过液相色谱进行分离以及利用质谱进行鉴定）通常耗时且技术要求较高。在完成纯化、定量及均一化步骤后，需对蛋白质进行酶解及样本纯化，以制备适用于LC-MS分析的样本（图1）。自动化这些工作流程可显著提升通量和可重复性。本研究采用 Opentrons Flex 自动化移液工作站的两套流程，实现了蛋白质酶解及 SP3 样本纯化步骤的自动化。

图 1. Opentrons Flex 自动化样品制备工作流程示意图。

Opentrons Flex 自动化移液工作站

1 实验方法

本项研究采用两个公开的运行程序，在 Opentrons Flex 平台上实现了胰蛋白酶酶解及样本纯化的自动化操作（图2）。蛋白质酶解方案首先将10 µg单克隆抗体（溶于100 µL 100 mM 碳酸氢铵的纯化重组兔 IgG）与10 µL二硫苏糖醇（DTT；60 mM）混合，随后在仪器搭载的热循环模块中于55°C孵育30分钟使蛋白质样本变性。继而向每个样本中加入10 µL碘乙酰胺（IAA；187.5 mM），并于室温下再次孵育30分钟以完成烷基化反应。最后向每个样本中加入10 µL质谱级胰蛋白酶（MS-grade trypsin；0.2 µg/µL），在热循环模块中37 °C孵育16小时进行溶液内胰蛋白酶酶解。

图 2. Opentrons Flex自动化蛋白质酶解与纯化的甲板布局示意图

基于Opentrons Flex的胰蛋白酶酶解工作流程的甲板布局示意图
• 板位A1与B1 - Opentrons Tough 96 孔全裙边PCR板（200 µL）的热循环模块
• 板位A2至D2 - Opentrons 24 孔离心管架（搭配 NEST 1.5 mL 离心管，24×4） 或者板位A2 - Opentrons Tough 96 孔全裙边PCR板（200 µL）
• 板位B3 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒（200 µL）
• 板位C3 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒（200 µL）
• 板位D3 - NEST 96 孔深孔板（2 mL）

基于Opentrons Flex的酶解后样本纯化工作流程的甲板布局示意图
• 板位A1与B1 - 搭载Opentrons Tough 96 孔全裙边PCR板（200 µL）（含酶解后样本）的热循环模块 
• 板位C1 ‒ NEST 单孔储液槽（290 mL）
• 板位D1 - 热振荡模块，搭载Opentrons 96孔深孔板适配器及NEST 96 孔深孔板（2 mL） 
• 板位A2 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒（1000 µL）
• 板位B2 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒（1000 µL） 
• 板位C2 - 环形磁力架
• 板位D2 - NEST 单孔储液槽（290 mL） 
• 板位A3 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒（200 µL）
• 板位B3 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒（200 µL） 
• 板位C4 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒（200 µL）
• 板位C3 - Opentrons Flex 96 孔滤芯吸头盒（200 µL）

基于 Opentrons Flex 的自动化 SP3 脱盐流程与 LC-MS 分析结果
蛋白质酶解完成后，Opentrons Flex 即刻执行了自动化 SP3 脱盐方案。简言之，酶解后样本从热循环模块转移至热振荡模块上的新工作板中，并与10 µL磁珠悬液（Cytiva Sera-Mag 羧基修饰磁珠；50 µg/µL）及乙腈（ACN, 1292 µL）混合以实现肽段捕获。通过磁分离收集磁珠，随后使用ACN（1000 µL）进行洗涤。肽段在2% DMSO（80 µL）中被洗脱。最终产物在仪器外进行真空干燥。LC-MS 分析显示，在各样品间基峰离子色谱图模式高度一致，并且能够可靠地检测到与兔 IgG 亚基相关的蛋白质。（图3）。

表 3.三批经纯化与均一化的单克隆抗体样本进行酶解与脱盐处理（样本 #1 和 #4、#2 和 #5、#3 和 #6 分别为同一批次的一式两份），并于纽约市立大学高级科学研究中心的 Bruker maXis-II ETD ESI-QqTOF/Dionex Ultimate-3000 LC 系统进行分析。
图中展示了基峰强度色谱图（离子流强度 vs. 保留时间）（左上）及检测到的蛋白质（右上）。

结论

Opentrons Flex 自动化移液工作站及公开可用的实验方案可用于实现蛋白质酶解与 SP3 样本纯化的自动化操作，并获得理想的样本处理质量。该方法为常规实验任务提供了便捷的解决方案，有助于降低人力需求，或将其整合到基于 LC-MS 的蛋白质组学分析的复杂工作流程当中。