应用笔记 | 告别繁琐手动，自动化NGS文库构建助力 miRNA 研究提速增效

还在为NGS miRNA文库构建的漫长手动操作和潜在人为误差烦恼吗？Opentrons Flex® 自动化移液工作站携手QIAGEN QIAseq® miRNA 文库试剂盒，带来全新的自动化解决方案！最新应用笔记证实，Flex 自动化移液工作站不仅能很好地复现手动操作的高质量文库，更将人工操作时间从2小时大幅缩减至仅10分钟，显著提升实验效率和标准化水平。本期文章将带大家了解这一高效工作流程如何赋能您的 miRNA 研究！

Opentrons Flex 自动化移液工作站

关键特性
Key features

自动化性能匹配：在 Opentrons Flex 工作站上自动化运行 QIAGEN 的 QIAseq miRNA 文库试剂盒，可产生与手动制备相媲美的高质量 miRNA 文库。
操作效率提升：自动化将人工操作点从六处减少至一 处，并节省约 2 小时的手动操作时间。
文库质控优化：使用 QIAseq Normalizer Kit 进行自动化文库均一化，相较于基于 qPCR 的均一化方法，可将文库质控时间额外缩短1至2小时，手动操作时间减少1小时20分钟。

1 实验方法

样本：使用100 ng Human XpressRef Universal Total RNA（QIAGEN，货号 338112）制备 miRNA 测序文库。
miRNA 测序文库制备： 分别通过手动方法和 Flex 自动化方法，使用 QIAGEN QIAseq miRNA 文库试剂盒（QIAGEN，货号 331505）制备 miRNA 测序文库。手动文库制备严格遵循制造商提供的操作流程。Opentrons Flex 自动化操作采用端到端的1天工作流程，可处理8至48个样本（图 1）。
文库均一化：采用 QIAGEN QIAseq Normalizer Kit（QIAGEN，货号 180615），工作流程A（图 2），将文库均一化至4 nM。
质量控制：使用Agilent Tapestation® High Sensitivity D1000 Screentape 检测 miRNA 文库质量及片段大小分布。
测序：文库在 Illumina MiSeq® 测序仪上进行双端读长75 bp（2x75）测序。
数据分析：使用 QIAGEN GeneGlobe miRNA 分析流程对 FASTQ 文件进行分析。

图 1：在 Opentrons Flex 上实现 QIAGEN QIAseq miRNA 文库试剂盒工作流程全自动化，可将人工操作时间减少近2小时
时间估算基于16个样本的通量。深蓝色：人工操作时间；浅蓝色：仪器运行时间。

图 2. 相较于基于 qPCR 的均一化方法，使用 QIAseq Normalizer 实现自动化均一化可使总时间减少约2小时，人工操作时间减少1小时20分钟。
时间估算基于8个样本通量；深蓝色：人工操作时间；浅蓝色：仪器运行时间

实验数据展示

 在 Opentrons Flex 自动化移液工作站上使用 QIAGEN QIAseq miRNA 文库试剂盒制备的文库，经 TapeStation HS D1000 分析确认文库片段大小及质量（图 3）。样本峰强度位于 ~200 bp，与预期文库大小吻合。

图 3. 均一化前 miRNA 文库的片段大小分布。制备的文库呈现约200 bp的预期大小，未见接头二聚体存在证据。

对均一化后的文库进行测序后，我们检测了通过 Flex 自动化移液工作站制备的16个样本的质量控制指标，包括 UMI 读段总数、注释 UMI 读段百分比及 UMI 读段 Q 值（表1）。Flex 制备的样本平均产生约 500 万 UMI 读段，其中 79% 的 UMI 读段可映射至 miRNA 序列数据库 miRBase。 UMI 读段的平均 Q 值为 43，表明碱基识别准确率超过 99.99%。分析发现， Flex 制备样本的注释 UMI 读段百分比与 QIAGEN 提供的参考数据及同实验室手动制备结果相当。这些结果表明，自动化流程构建的文库具备高质量测序特性。

表1. 制备的miRNA文库质量控制摘要

结论

本研究展示了在 Opentrons Flex NGS 工作站上实现 QIAseq miRNA 文库试剂盒全自动化制备的方法。自动化构建的文库质量优异，与手动方法性能相当，同时显著减少人工操作时间及操作节点。进一步结合 QIAseq Normalizer 的自动化文库均一化模块，文库制备与均一化的总时长缩短约2小时，节省人工操作时间逾3小时。该方案使得 NGS 技术人员可在8小时工作日内完成文库制备，其中人工操作时间仅需20分钟。最终获得的4 nM 双链 DNA 文库可直接用于混合测序或低温存储。

当前方案虽基于48样本通量设计，但 Opentrons Flex 自动化移液工作站兼容标准96孔板格式，单次运行可自动化处理多达96个样本。这种通量提升对生物标志物发现等大样本量研究至关重要。