免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)

需要免疫沉淀的工作流程

• 蛋白质-蛋白质相互作用研究： 鉴定和验证与相关蛋白质相互作用的蛋白质。
• 翻译后修饰分析： 富集具有特定修饰（如磷酸化或泛素化）的蛋白质。
• 功能测定： 在受控环境中研究蛋白质或蛋白质复合物的活性。

免疫沉淀的最佳方法

免疫沉淀（Classic Immunoprecipitation, Classic IP）

从复杂混合物中分离出特定蛋白质，用于研究其特性、翻译后修饰或进一步分析。

1. 使用裂解缓冲液裂解细胞以释放蛋白质。
2. 将针对目标蛋白质定制的特异性抗体附着在珠子（琼脂糖或磁性）上。
3. 细胞裂解液与抗体-磁珠复合物孵育，使目标蛋白质结合。
4. 使用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的蛋白质。
5. 然后使用洗脱缓冲液将目标蛋白质从珠子上洗脱下来。
6. 使用离心机或磁力架从裂解液中分离出与抗体珠结合的蛋白质。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）

从复杂的生物样本中分离出主要蛋白质及其潜在的相互作用伙伴，从而研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

1. 细胞裂解以释放蛋白质。
2. 将针对原生蛋白定制的特异性抗体附着在珠子上。
3. 细胞裂解液与抗体-珠子复合物一起孵育。
4. 在此步骤中，与原生蛋白相互作用的蛋白质会发生共沉淀。
5. 非特异性结合的蛋白质会被洗去。
6. 原生蛋白及其相互作用蛋白被洗脱。
7. 使用离心机或磁力架分离与抗体珠结合的蛋白质。

串联亲和纯化 (Tandem Affinity Purification, TAP)

实现蛋白质复合物的高纯度纯化，尤其适用于研究低丰度或瞬时蛋白质-蛋白质相互作用。

1. 对感兴趣的蛋白质进行基因改造，使其包含双标记系统。
2. 对表达这种修饰蛋白的细胞进行裂解。
3. 首先将裂解液与与第一个标签结合的珠子孵育，分离出蛋白质。
4. 使用特定的蛋白酶将第一个标签裂解掉。
5. 使用与第二个标签结合的珠子进行第二轮纯化。
6. 经过这一步骤后，蛋白质复合物被洗脱出来，纯度很高。
7. 使用离心机分离与珠子结合的蛋白质。

为什么免疫沉淀很困难：

• 特异性问题： 蛋白质与珠子或抗体的非特异性结合会导致假阳性。
• 灵敏度问题： 低丰度蛋白质可能无法被有效吸附，从而导致假阴性。
• 维持蛋白质相互作用： 有些蛋白质与蛋白质之间的相互作用是瞬时或微弱的，因此在 IP 过程中捕获并维持这种作用具有挑战性。

如何实现免疫沉淀过程的自动化：

• 液体处理工作站： 这些工作站可自动添加和移除溶液，确保移液的一致性和精确性。
• 磁珠分离： 自动化平台可处理磁珠分离，减少操作时间并提高一致性。
• 整合系统： 有些平台将样品制备、IP 和下游分析（如质谱）整合到一个工作流程中。

免疫沉淀自动化比手动移液的优势：

• 一致性和可重复性： 自动化减少了人为错误和可变性。
• 通量： 自动化系统可同时处理多个样品，提高效率。
• 降低污染风险：尽量减少人工操作，降低样品污染的几率。
• 优化方案： 自动化系统通常带有优化的操作程序，可确保获得最佳结果。