文库定量的常见方法与技巧

在探索高通量测序（NGS）的广阔领域中，文库定量作为确保测序数据质量与深度的关键环节，扮演着至关重要的角色。这一步骤不仅关乎实验的成功与否，还直接影响到后续生物信息学分析的准确性和可靠性。随着技术的不断进步，文库定量的方法日益多样化，每种方法都各具特色，适用于不同的实验场景和需求。

文库定量

一、文库定量的重要性
1、确保测序数据质量：文库定量可以确保测序仪上载入的DNA文库量适中，从而避免文库浓度过高导致的低质量测序数据或文库浓度过低导致的测序数据产量不足。
2、稳定产出各样本数据量：在多个文库合并测序时，文库定量有助于根据测序数据量的要求混合相应摩尔量的文库，以稳定产出各样本数据量。

二、常见方法
1、紫外分光光度法
（1）原理：核酸（包括DNA和RNA）中的碱基含有芳香环结构，因此具有紫外吸收的特性。核酸的紫外吸收峰在260nm处，与此同时，还能通过计算A260/A280和A260/A230的数值，估计核酸的纯度（280nm吸光通常来自蛋白质，而230nm则通常来自糖类和苯酚等）。
（2）缺点：无法区分DNA和RNA，因为具有紫外吸收的结构是核酸的碱基，而DNA和RNA均含有碱基，因此当一份样品同时含有DNA和RNA的时候，测定浓度会高于其真实浓度。
2、荧光染料法
（1）原理：使用靶标特异性染料，该染料可以特异地与不同种类的核酸链相结合，并在特定波长光源的激发下发出荧光。其中，结合了核酸的荧光染料相比那些游离的，信号可增幅数十倍至数百倍，因此可以和背景区分开来。
（2）操作：将待测DNA样品与荧光染料混合，荧光染料会与DNA结合，形成荧光复合物。然后将混合物放入Qubit测量仪器中，仪器会通过激光激发荧光复合物，使其发出荧光信号。Qubit测量仪器会根据荧光信号的强度自动计算出DNA的浓度。
（3）优点：灵敏度高，操作简便快速，检测流程高效，可以轻松地分析数十个样本，内置的分析软件简化了数据计算，在检测结束后立即呈现文库浓度。
（4）缺点：当样本增加到20~30个以上时，此种检测方法不太适用；检测的准确度略低，结果一般不作为终浓度用于上机。
3、实时荧光定量PCR法（qPCR）
（1）原理：利用荧光检测技术与PCR技术相结合，在PCR反应体系中加入荧光基团，通过实时监测整个PCR过程中荧光信号的变化情况，反映浓度的变化，最后通过已知浓度的标准曲线计算未知样品的浓度，以达到准确定量文库浓度。
（2）优点：特异引物仅会定量两端接头连接完整的文库，可排除单端或双端都不连接接头的不可测序文库的干扰，准确度高，是目前业内进行文库定量推荐的方法，适用于测量珍贵样本以及文库上机pooling前的精准定量。
（3）缺点：成本较高。

三、技巧
1、消除和避免核酸污染：文库定量使用的Standards浓度从高到低，高浓度Standards容易对环境造成核酸污染，从而影响阴性对照和低浓度Standards的结果。因此，做文库定量的实验室需要定期除核酸。可以在实验技术后，用紫外处理，将环境中的核酸氧化。
2、文库稀释验证：文库建议稀释2个梯度，相互验证。说明书上建议是10000倍和20000倍，在具体实验操作时设置2个梯度浓度相差10倍也可以。要注意的是10000倍和20000倍得出的Ct值的差应该为1附近，可以在0.951.05之间，10000倍和100000倍得出的Ct值差在3.34附近，可以在3.23.5之间，如果超出这两个区间，则2个梯度的误差会比较大，这种误差有可能是稀释不准引起。
3、排除扩增效率影响：当计算的结果出来，发现文库稀释成2个梯度所获得的浓度偏差较大时，可能是由于稀释不准，或者该文库的扩增效率较低，导致△Ct偏大。此时，可以将这个文库做4~5个10倍稀释梯度，上机，根据上机的Ct值计算扩增效率，从而排除扩增效率的因素。

文库定量作为高通量测序流程中的关键环节，其重要性不言而喻。通过合理选择定量方法和灵活应用定量技巧，科研人员能够更加精准地掌握文库的质量信息，为后续的生物信息学分析和科学研究奠定坚实的基础。

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