应用笔记 | Opentrons Flex 驱动的全自动化样本制备，助力 TMT 标记多重 LC-MS 蛋白质组学分析

蛋白质酶解与纯化处理是基于质谱（MS）的蛋白质组学研究中获得高质量肽段的关键步骤。该过程耗时耗力。为了能实现多样本同步分析、提高通量并减少批次间差异，有时候会使用串联质谱标签（TMT）进行样本多重标记，这进一步增加了实验台操作的复杂性。

肽段样本制备的实验室自动化可显著减少手动操作时间，最大限度降低人为错误风险，并提高通量。本文介绍一种在 Opentrons Flex 平台上实现的全自动工作流程，用于胰蛋白酶/Lys-C 介导的蛋白质酶解、基于磁珠的纯化处理，以及使用市售试剂盒进行 TMT 标记。

Opentrons Flex 自动化移液工作站

一 实验方法

1. 将样品（纯化的牛血清白蛋白 BSA 或 HeLa 细胞裂解液）、试剂（EasyPep Magnetic MS Sample Prep Kit 和 TMT Mass Tagging Kit，Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）以及配套耗材手动装载至 Opentrons Flex 移液工作站上。
2. 在配备全集成式热循环模块（提供精确温度控制）的 Opentrons Flex 平台上，开发并优化了两个操作流程：

3.  通过 LC-MS 分析评估最终产物的质量。

图 1. 流程 1：蛋白质酶解和 TMT 标记。Flex 甲板布局（左）和工作流程（右）。

图 2. 流程 2：样品纯化。Flex 甲板布局（左）和工作流程（右）。

二 实验结果

使用BSA进行流程验证（图3）  

1、每个样本中，纯化的牛血清白蛋白（BSA）经酶解后，分别用 TMT2-126 或 TMT2-127 等质量的同位素标记，按1:1比例混合，并经脱盐处理后进行 LC-MS 分析。  

2、通过 Opentrons Flex 进行的三次独立测试数据显示，TMT 标记效率保持稳定均一（127/126比值平均值为1.039），与标准手动操作流程结果相当。

图 3. 使用 BSA 进行流程验证的图示  

左下角：经不同 TMT 标记的多肽片段示例；  
右上角：通过 Opentrons Flex 处理的3次测试（Flex #1-#3）及按供应商方案手动处理的1次测试中，TMT2-127 与 TMT2-126 标记的 BSA 酶解产物比值对比

HeLa 细胞裂解物的样品制备（图 4）

每个样品取两批 HeLa 细胞裂解物（100 μg）进行酶解，分别用 TMT6-127 和 TMTzero 同位素标签标记，按 1:1 比例混合后脱盐，随后进行 LC-MS 分析。
酶解后的肽段被两种同位素 TMT 完全标记（标记效率 99%），且两种标记的比例接近 1:1（重标 / 轻标比例≈1）。
在 3 次独立实验中（均使用 Opentrons Flex 处理样品），基峰色谱图的良好对齐及包括多重标记效率在内的其他数据均保持一致。数据与手动操作流程相当，表明该自动化工作流程具有较高准确性。

图 4.HeLa 细胞裂解液样本制备结果。

左上：基峰色谱图；右上：两种 TMT 标记肽段比值（TMT6-127：重标；TMTzero-126：轻标）；右下：使用 Opentrons Flex 处理的3次测试（Flex #1-#3）及按供应商方案手动处理的1次测试的标记效率对比。

结论

基于 Opentrons Flex 开发的完整肽段制备工作流程，实现了 TMT 辅助多重 LC-MS 分析的全自动化操作，具备良好的一致性、更高通量及优质样本处理能力。该自动化方案显著减少了手动操作时间，只需小于10分钟的试剂准备和耗材装载，大大节省了宝贵的实验台时间。