如何提高移液資料的重現性？

1 引言鑑於對資料可靠性的顧慮，以及無法重現已發布的研究結果，生命科學正陷於「重現性危機」之中。大多數科學研究人員報告未能重現實驗（包括其本人的實驗），因此需要採取更多步驟來改善已發布的研究結果的可靠性與可信度。但是，有哪些因素導致了這種科學“危機”，應如何實施簡單的移液解決方案來應對這一危機？本白皮書概述了重現性危機的嚴重程度，探討了造成實驗無法重現的五個主要因素，並討論了良好的移液器選擇和技術如何避免因液體處理不准確而導致可重現性差的問題。

2 資料重現性危機重現性不僅是特定時間、地點或人物的人為現象，它也是科學方法的基石，是確認所觀察到的結果是否符合假設的必要條件。科學界依靠同儕審查出版流程來確保科研成果準確無誤，這意味著從表面上看，大多數科研成果一經發布便很少受到質疑。因此，很少有人會重複這些研究，已發布研究結果即被視為事實，而研究領域則可能建立在一個不可重現的研究結果之上。我們目前專注於減少在科學研究中使用動物進行實驗（例如「3 R」框架，透過動物替代、動物減少和研究改進來進行更人道的動物研究），而這進一步加劇了這一現象。這個框架建議優先考慮「真正進入知識庫」的研究，但這無法促進現有知識的重現。然而，如果特定研究結果無法在不同環境下由不同人員重現，則我們不能這一結果視為真正的科學現象，只能將其視為特定實驗條件下的產物。

John Ioannidis於2005年發表了題為「為何大多數已發表的研究結果都是錯誤的」(1) 的期刊文章，此文頗具爭議，（生物）醫學領域的可重現性危機由此成為人們關注的焦點。模擬與建模結果表明，對於大多數研究設計而言，已發布研究結果很可能是錯誤的，它們只是當前普遍偏差下的準確測量。

近二十年前就有人提出了資料重現性問題，如今這一問題仍然普遍存在。近期，《自然》的一項調查結果顯示，70%以上的科學研究人員報告未能重現已發表的實驗結果 (2)。而令人擔憂的是，50%以上的科學研究人員報告未能重現自己的實驗。現在大家一致認為，這個問題非常嚴重，已經導致生物學領域和醫學領域深陷重現性危機。大多數研究人員表示，儘管自己認同這個觀點，但還是相信已發表的文獻。

重現性危機不僅擾亂了基礎科學的知識庫，也嚴重影響了工業應用的開發計畫。顯然，我們需要利用解決方案來提高數據可靠性和解決科學領域的重現性危機，但有哪些因素會導致缺乏可重現性？

3 影響資料重現性的因素想要應對重現性危機，首先要承認科學界存在資料重現性問題，然後應該考慮和了解影響資料可靠性的主要因素，再在整個實驗過程中（從初始規劃到實驗程序和最終分析）採取步驟來避免這些因素。

3.1 文化可以說，沒有察覺到研究不可重現的主要原因在於，當前科學文化不鼓勵發表負面研究結果。科學研究人員無法重現某一實驗通常是因為沒有正確進行實驗、缺乏必要技能，或是因為可用方法方案的細節不足以支持重現實驗。然而，即使在眾多實驗室成員在嘗試多次仍失敗後認為實驗不可重現，各雜誌也可能不願意發表負面研究結果。即使發表了，負面研究結果通常被視為具有爭議且會被反駁。正如《自然》的調查結果中所述，「數位曾公開發表實驗重現失敗結果的受訪者表示，編輯和審稿人要求將這些研究和初始研究進行比較。」但知名期刊認識到了這個問題，因而發表負面研究結果比以往更容易，其中包括雜誌PLOS One雜誌的特刊“The Missing Pieces：負面結果、無結果和無法得出結論的研究結果”文章合集(3)。

3.2 強調P值研究中不可重現率較高很可能是因為研究者根據在單一研究中觀察到的統計顯著性（通常P值小於0.05）聲稱得出結論性結果。顯著性P < 0.05這一黃金標準也可能導致研究人員錯誤地解讀錯誤的結果，這一標準不一定能夠確認研究結果具有實踐意義和重要意義，也無法表明在其他地方進行同一實驗時數據是否仍然具有顯著性。依賴是否達到統計顯著性來認定某項研究是否值得發表，導致了科學研究人員採取「p值操縱」的做法 (4)。這種惡意行為可能包括設計和進行實驗，透過資料疏浚、資料捕魚、資料探勘或資料擷取來確保結果具有顯著性或利用資料分析。

3.3 缺乏透明度和原始數據僅在最近幾年，才開始鼓勵向研究人員提供研究背後原始數據的完全存取權。然而，在生物醫學領域，因為研究成果可以透過商業化產生巨大財富，數據收集和分析的具體方式仍然缺乏透明度。老實說，期刊文章有字數限制，因此在許多情況下難以包含成功重現複雜實驗所需的所有方法細節。而在其他需要考慮商業前景或智慧財產權前景的領域，原稿中可能會刪除或混淆專有資訊。如果原始資料本身提供了有價值的產物（例如影響藥物研發的基因組資料庫），則這些資料通常會出於商業原因而處於保密狀態。因此，外部研究人員無法獨立驗證已發表的研究結果，因此無法確定該結果是否具有可重現性和結論性。

3.4 實驗室規範和記錄保存不當從較為基本的層面來講，實驗不可重現可能是因為初始實驗科研人員和重複實驗科研人員的實驗室技術不佳，他們應該盡可能採用標準方式來施用技術，以便其他科研人員也可以使用這些技術。如果針對某一特定方案（可能無法透過文字方案來理解）開發了新技術，則可以隨附影片教學。細小步驟可能會被忽略，沒有包含在已發布的方法方案中，因此，記錄不詳細也會影響可重現性。

3.5 非標準設備的品質各異多種可用的實驗室設備和儀器也會影響方案的標準化。不同品牌儀器的整體功能也許相似，但其精準度可能各有不同。不同品牌之間靈敏度、特異性、檢測程度等方面的差異可能會對實驗結果產生顯著影響。因此，需要提供詳細的材料和設備清單以及已發布的方案，明確說明所用物品的品牌、型號、批號等資訊。應盡可能使用優質設備和材料，以減少可能與更廉價材料相關的差異。設備未經校準以及在科研人員不知情的情況下更改實驗參數都可能會進一步加劇這些問題。

4 透過易於實施的移液解決方案來提高重現性重現性危機是一大系統性問題，科學方法的許多階段都需要考慮這個問題並採取解決方案，但可以從改進簡單流程開始來提高數據可靠性。改進涉及多個科學工作流程階段的流程可以提高資料可靠性，從而獲得高回報。

我們的使命是創建可靠且易於驗證的高精度儀器，以幫助研究人員實現可重現的科學。手動移液是一種容易忽略的生命科學工具，這種工具要求準確度要精確到微升級，可以說在所有過程中都使用得比較多，因此是提高可重現性的關鍵過程。幸運的是，移液解決方案操作簡單且經濟實惠，對整個工作台工作流程中都有著正面影響。

4.1 選擇優質移液器如要實現可重現移液，要先選擇在整個移液循環（吸液和分液）中都準確無誤的優質移液器。移液管的真實值（亦稱為準確度）是指吸取並分配接近容量設定所示的真實值或標稱值溶液容量的能力。移液器的精度是指在多次重複操作中分配相同容量溶液的能力。因此，可以透過平衡高真實值和/或高精度來實現移液器的整體移液性能，從而分別實現低系統誤差和/或低隨機誤差。

選擇優質移液管後，仍有多種因素會對準確度產​​生負面影響：

• 使用者技術
• 環境因素（包括溫度、濕度和壓力）
• 液體樣品特性（即高黏度）
• 仪器误差
  尽管这些因素难以控制，但使用高端仪器对于提高移液器的性能而言是简单易行的解决方案。

所選移液器應採用先進的製造工藝，以達到能維持長期準確（真實值和精度）的允差。購買新的移液器時，應比較供應商之間所述的系統誤差規格和隨機誤差規格。為說明不同品牌之間的差異，表1比較了2 µL、20 µL、200 µL和1000 µL 標稱值範圍內高階移液管和低端移液管之間的技術規格。整體而言，高端儀器的隨機誤差性能更佳。此外，應特別注意低容量移液器— 即分液容量小於10 µL的移液器，因為移液技術和樣品黏度對低容量分液的負面影響較大，會導致準確度降低和預期容量減小。因此，使用者應選擇出廠時儀器誤差較小的移液器。

對於精度和重複性要求較高的分子工作流程（如逆轉錄-聚合酶鏈反應，RT-PCR）來說，劣質儀器相對較低的精度會對實驗的可重現性產生顯著影響。

4.2 確保正確實施日常維護、校準與性能驗證移液器是實驗室中廣泛使用的設備，經常遭受磨損。移液器由多種機械零件構成，這些零件彼此可以移動，經常接觸到腐蝕性化學物質或有害化學物質。和所有其他機械性產品一樣，移液器零件會隨著時間的推移而劣化，進而嚴重影響移液管性能。高端的移液器和儀器可以保證比低價的替代品更經久耐用，但它們仍然需要定期維護、驗證和校準，以確保在實驗中保持一致的性能和可重現性。

移液器維護移液管維護包括日常保養和預防性維護。妥善保養移液管可盡量提高維修間隔期間的效能、防止移液管因損壞而無法使用。可以進行簡單的日常活動，以確保移液器正常運作。

定期檢查移液管是否有任何可見的損壞跡象，例如移液管外殼有刮痕或破損。這項活動可以指示移液管是否掉落，移液管掉落可能會導致損壞，並且需要維修或校準。

定期清潔移液器，以防灰塵或污垢進入工作件，進而導致工作件摩擦或卡住。使用製造商建議的無磨蝕性清潔溶液清潔移液器，然後使用無絨布擦拭移液器。

正確消毒移液器（將暴露在紫外光下的時間限制在10-15分鐘），以免移液器外殼的完整性受損。持續高壓滅菌導致移液器經常暴露在高溫、高壓和高濕度條件下，這也可能影響其性能，因此應在每次高壓滅菌後進行性能驗證。

安全存放移液器，將其置於適當的盒裝或平台裝置中，以防掉落和損壞。

切勿倒置移液管（液體處理期間），以免液體進入儀器。濾芯吸頭有助於防止液體和污染物進入移液管。

日常保養移液器有助於在維修間隔期間維持移液器性能，但預防性維護對於防止移液器突然故障仍然至關重要。 Rainin服務數據顯示，如果沒有進行任何預防性維護或執行定期維修程序，那麼即使每年都進行檢查，移液器的故障率仍會達20%或以上。大約95%的移液器故障都是因為密封系統缺陷，這種故障可以預測，也可以預防。預防性維護旨在更換磨損的組件（例如O形環、密封件和柱塞），以免其發生故障並進一步損壞周圍部件。

根據製造商的建議和我們的豐富經驗，在正常使用條件下，密封件應每年至少更換一次，而吸頭支架和活塞應每三到五年更換一次。預防性維護有助於確保維持移液器效能、防止移液器故障和維持實驗合規和可重現，進而避免工作流程中斷。

校準建議每年至少進行一次預防性維護，以確保移液器功能操作正常，但需要增加移液管的校準頻率，以確保其準確度保持在（亞）微升級。真實的吸液量和分液量無從知曉，因此移液器校準不當會顯著降低實驗的可重現性，進而導致已發布的實驗方案不準確。