在OT-2上使用Thermo Fisher Dynabeads 進行免疫沉澱

作者

BO人  Lin,PhD1,kin那日  Watson,PhD了 1open TR ONS  lab works,Inc.

摘要本次研究在Opentrons OT-2自動化移液工作站上進行了自動化的磁珠法免疫沉澱測試，實驗流程可處理多達96個樣品，並最大限度地減少人工操作時間。我們用裂解緩衝液稀釋重組GAPDH 蛋白或直接使用HEp-2 細胞裂解產物進行樣本製備，並偶聯蛋白G 或蛋白A, 然後在Thermo Fisher Dynabeads 上進行免疫沉澱實驗(蛋白G和蛋白A 可與可溶性抗體結合，進而促進隨後與目標蛋白GAPDH 的結合)。蛋白質分析結果顯示，目標蛋白質成功地從樣品溶 液中提取出來，並符合預期效果的一致性，證明了 OT-2 具備自動化進行免疫沉澱實驗的能力。

簡介免疫沉澱是一種常見的實驗方法，利用抗體在分子混合物 中捕獲目標蛋白質。抗體可以預先連接到固相基質(如瓊 脂糖樹脂或磁珠)上，然後與目標蛋白質接觸，或直接 與樣品一起加入相應的固相基質。由於孵育時間取決於抗 體與目標蛋白質的親和力，不同的目標捕獲蛋白所需的孵化時間也會不一樣。使用磁珠萃取，抗體-蛋白質-磁珠複合物會以離心或磁力的方式進行沉澱物收集。

DynabeadsM(Thermo Fisher Scientific,USA) 是一款可 以需求調整以獲得不同功能的超順磁珠。例如，重組的 蛋白G或蛋白A可以共價地結合到磁珠表面。蛋白G和蛋白A 都是細菌蛋白，對單株或多株 IgG 型抗體的 Fc 區域表現 出高親和力。 DynabeadsT​​M- 蛋白G 或 DynabeadsT​​M- 蛋白 A可作為抗體的固相支撐材料。 Opentrons 以 DynabeadsM為基礎設計了高效自動化的實驗程序進行免疫沉澱實驗，每次實驗可處理最多96個樣品，樣品之間具有良好的重複性。

材料和方法實驗步驟包括以下內容：第一部分是磁珠、抗體和樣品的混合製備；由使用者確定的抗體/目標蛋白的孵育時間；第二部分是洗滌和洗脫步驟(圖1)。第一部分和第二部分在 OT-2 上進行，使用磁珠純化模組將磁 珠從溶液中分離出來，並使用溫控模組製備變性蛋白的洗脫液進行 SDS-PAGE。 孵育過程在熱振盪儀(選配)上進行。免疫沉澱實驗的第一部分和第二部分的 OT-2 裝載佈局如圖2 所示。這個流程旨在將試劑直接從15 mL 離心管轉移到工作板上進行磁珠分離。另外，在 OT-2 上使用自動化程序預先填入試劑板，可以減少實 驗時間。抗體與目標蛋白的結合是免疫沉澱成功的最關鍵步驟 驟，這取決於抗體的親和力。對於結合親和力低或豐度較低的抗體，建議在樣品溶液中進行預孵育。

結果兔子IgG 對蛋白G 和蛋白A 都具有高親和力，為了確認抗體與DynabeadsM 的相互作用，我們使用了抗GAPDH 的免多克隆gG 抗體(ProteintechRosemont,IL,USA) 。 在 OT-2 上，將 50μL 的磁珠懸浮液與含有2.5μg GAPDH 抗體的200μL PBS 混 合，然後在室溫下於振盪器上800 rpm 混勻10分鐘。隨後，在 OT-2上以0 . 1% Tween 20 的磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (PBS-T) 洗滌3次。 70°℃加熱10分鐘、使用Laemmli 樣品緩衝液 (Bio-Rad,USA) 洗脫結合的 GAPDH 抗體。然後，將其進 行SDS-PAGE 分離，再以近紅外線發光染料 (IRDye 680RD)偶 聯的山羊抗兔 IgG 抗體 (LI-COR Biosciences,USA)進行探針偵測。 Western Blot 分析結果顯示，當進行四次重複操作時，無論是蛋白G 或蛋白A 磁珠都能夠與 GAPDH 抗體結合(圖5A), 且結合具備可重複性。為了進行 GAPDH 的免疫沉澱，我們在 OT-2 上使用含有重組 人類 GAPDH 蛋 白(rhGAPDH,Thermo Fisher Scientific, USA) 的樣品進行免疫沉澱處理。同時使用結合了 GAPDH 抗 體的 DynabeadsT​​M-蛋白G和蛋白A的 GAPDH抗體進行測試。 Western Blot結果顯示出GAPDH 的存在，驗證了OT-2 具備運行自動化免疫沉澱的能力(圖5B)。此方法也針對培養細胞中內源性 GAPDH 進行了自動化免疫沉澱評估。 HEp-2 細胞在含有10%胎牛血清和1%青黴素-鏈黴素的 GibcoTM最低基礎培養基(Thermo Fisher Scientific,USA) 中培養，在5% CO2 和37°℃條件下進行。為了準備測試的細胞裂解液，收集了4 x106 個 HEp-2 細胞，並在200μLPierceTM IP 的裂解緩衝液中進行裂解，該緩衝液中還加入了Thermo Fisher Scientific 提供的蛋白酶抑制劑混合物。使用DynabeadsT​​M- 蛋白A在 OT-2 平台上進行免疫沉澱實驗，OT-2移液平台搭載了磁珠純化模組和溫控模組。為了讓抗體與目標蛋白結合有足夠的時間，將混合物放置於4°℃熱振盪儀上，並在800 rpm的轉速下孵育過夜。最後透過Western Blot 定量，結果進一步證明了本次免疫沉澱實驗成功具有良好的重複性(圖6)。本次實驗處理了96個樣本，免疫沉澱的細胞裂解液加載在96孔樣品板的最後一列，而樣品板的其餘位置只裝載了裂解緩衝液。

結論OT-2 在中高通量工作流程中利用 Dynabeads 進行自動化免疫沉澱具備較好的能力和實用性。我們開發的應用協定能夠取代手動程序，並減少了操作時間，同時提供了優秀的重複性。

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