使用RNAdvance Viral和OT-2平台，進行高效且高通量的SARS-CoV-2病毒RNA檢測及定序研究

應用介紹2020年新冠病毒肆虐全球，激化了人類對於臨床研究目的的高通量 RNA 檢測和基因定序的需求。傳統手動操作方案難以提升RNA 檢測的效率。在本項研究中，我們展示了在 Opentrons OT-2 自動化移液工作站上使用 Beckman Coulter Life Sciences RNAd- vance Viral 試劑盒 (C63510) 的自動化 SARS-CoV-2 RNA 萃取工作流程。 我們提供的分析數據顯示了透過 qRT-PCR 定量的SARS-CoV-2 檢測極限(LoD) 和序列比對數據，這些數據為自動定序樣本和文庫製備提供了依據，以便對突變株進行遺傳鑑定。

RNAdvance 病毒試劑盒和 OT-2 平台概述RNAdvance Viral kit 透過利用 SPRI 順磁珠技術，從樣本中高效提取病毒RNA。 我們在自動化的Opentrons 平台上使用了這種試劑，從合成鼻基質(110mM NaCl,1%w/v的豬胃I 型黏液(Sigma M2378-100G) 和10μg/mL w/v人類基因組DNA(Coriell NA12878), 以90%v/v 的TE/SNM) 樣本中提取了不同濃度的熱滅活的SARS-CoV-2(ATCC°VR-1986HKTM) 。 每個濃度包括20 個測試樣本、2個陽性對照和2個陰性對照。

工作流程吞吐量圖1顯示了自動化 RNAdvance 病毒提取工作流程的 OT-2甲板佈局。此工作流程從向樣品裂解液中添加 Bind (BBB)開始，每個樣 品僅需要消耗10個吸頭，可靈活運行8個批次大小的最多96個樣本。報告中所述的工作流程持續時間包括實際操作時間、樣品裂解時間和優化後樣品的運行時間(圖2)。使用RNAdvance Viral試劑盒和OT-2平台，處理96個樣本的工作流程總共需要3.5小時，您可以複製連結到瀏覽器，查看特定協議流程： https://protocols.opentrons.com/protocol/bc- rnadvance-viral。您可以根據您的需求靈活地改變方法變量，以獲得您所需的批次大小、樣品輸入和洗脫體積的所需結果。

此工作流程在  OT-2 上是可以全自動運作  的，每個樣本使用10個吸頭，並從加入Bind(BBB)    開始。實驗甲板上耗材內容有：最多10個吸頭架、1個 NEST 單孔儲液槽、2個 NEST 12 孔儲液槽、1個NEST 0.1mL PCR板及1個 NEST  2mL 深孔板，模組包括一個磁珠純化模組和一個溫控模組，配備一個 P300 多通道移液器。所有的 NEST 耗材和模組都由 Opentrons 提供。

圖2:在OT-2平台上使用RNAdvance Viral試劑盒的吞吐量狀況整個工作流程運作所需的時間包含3個部分：操作時間、裂解時間和運行時間。操作時間包括樣品和OT-2的準備工作。運行時間指的是 OT-2從開始到完成整個協議所需的時間。 A)處理8個樣本需要45分鐘，處理96個樣本需要2小時38分。 B) 圖形化顯示了不同樣品數量下的運轉處理時間。

RNAdvance 病毒試劑盒檢測限制檢測限制(LoD)是用於確定OT-2平台上自動化RNAdvance Viral萃取效率的指標，它表示能夠在≥95%的重複測量中檢測到的病毒拷貝數 的最低濃度。我們使用2019-nCoV CDC N1和RP引子和探針(2019-nCoV CDC EUA kit,Integrated DNA Technologies (IDT)) 進行偵測，PCR 混合液和酵素使用Luna°通用探針一步RT-q England BioLabs),PCR反應在PCRmax ECO48即時PCR 系統上進行。在SARS-CoV-2 樣本 (n=20) 和陽性對照樣本 (n=2) 中檢測到病毒RNA (拷貝數/μL), 但在陰性對照樣本 (n=2) 中未檢測到。根據表1的總結，分析範圍內的所有對比陽性樣本均被確定為陽性，其中最低濃度的病毒RNA 拷貝數為1拷貝/μL。 PCR 參數如下。

表1:使用OT-2 平台和 RNAdvance Viral 試劑盒檢測 SARS-CoV-2 目標 N1 的病毒靈敏度。 1 copy/μL 是能夠偵測到≥95%樣本的最低濃度，被定義為偵測限制 (Limit of Detection,LoD)

為了研究 RNAdvance Viral在 OT-2 上的自動化性能，我們將850 copy/μL 濃度的熱滅活 SARS-CoV-2 病毒加入合成鼻腔基質中，並萃取RNA。 針對N1和RP, 確定了均值Ct值、標準差、變異係數 (CV%) 和檢測率等規格參數(圖3A)。在實驗樣本(n=20)、 陽性對照樣本(n=2) 和陰性對照樣本(n=2) 中，對N1 的擴增曲線進行定量分析(圖3B), 同時對包括對照樣本在內的樣品中的RP進行定量分析(圖3C)。

DNA 定序與數據分析為了進一步了解定序性能，我們使用Swift 2S Turbo DNA文庫製備試劑盒和 Swift Unique Dual Indexing 引子板進行 N1擴增。關於850 copy/μl 樣本的詳細資料和序列比對結果可以在圖4 中找到。我們觀察到平均覆蓋率為 455x, 且平均讀數有91%與參考基因組 SARS-CoV-2 分離自Wuhan-Hu-1(NC_045512.2) 對齊。讀取長度與 N1擴增區域相匹配，大約為72個鹼基。根據Swift 2s Turbo DNA 文庫製備試劑盒製造商的說明，預期插入片段大小約為 200bp。 定序是使用 lllumina MiSeq 進行的，並將篩選資料上傳至llluminaBaseSpace。在 Galaxy 中使用 Bowtie2 確定了覆蓋度，並使用 Integrative Genome Viewer(IGV) 進行視覺化。 NC_045512.2,SAR2-COV-2, 分離源自Wuhan-Hu-1 的基因組是用於定序的NCBI參考基因組。透過在 Galaxy 中使用QualiMap-BAMQC 工具，分析了調準、讀長、片段大小和CG含量等資訊。

A) 綜合數據QC 表描述了多個數據點，包括455-x 的平均覆蓋率和與參考基因組對齊的平均讀數，SARS-CoV-2 分離株Wuhan-Hu-1 (NC_045512.2) 為91% 。根據 Swift 2s Turbo DNA Library Prep 製造商的預期插入片段大小約為200bp。 B)每個樣本與參考基因組對齊的比較。

總結本研究透過 Beckman Coulter Life Sciences RNAdvance Viral 試劑盒和 Opentrons OT-2 提供了一個穩定、高性價比的自動化萃取方 案。此工作流程經過優化，用於SARS-CoV-2 病毒 RNAPCR 檢測，在LoD (檢測限制)為每微升1個拷貝時進行了測量。我們使用了高 通量定序 (NGS) 進行測試，在平均樣本覆蓋度達到455 X 和平均讀取對齊到 SARS-CoV-2 參考基因組的91%。該研究表明，利用 RNAdvance Viral 試劑和 Opentrons OT-2 進行樣本萃取可以實現高效且經濟的 SARS-CoV-2 病毒 RNA 萃取。同時，在定序分析方面， 此方案具有高平均覆蓋率和較高的對齊率，能夠為研究人員提供具有重要意義的遺傳資訊。這對於致力於研究SARS-CoV-2 病毒的臨床研究人員來說，為他們的工作提供了一個高效、可行的樣本準備方案。