使用DNA製備試劑盒自動製備小基因組的文庫

摘要三個圖書館準備工具包-Illumina®DNA準備工具包，KAPA®超級準備工具包和NEBNext®Ultra™II試劑盒-都是透過Opentrons OT-2自動快速和穩健地製備下一代定序的高品質文庫。從lambda和人類基因組DNA中製備了100 ng輸入的文庫。觀察到庫的類似性能，用OT-2上的三個套件準備的樣本變異性和產量。類似的排序指標，如條碼平衡和序列比對也觀察到覆蓋範圍。

介紹DNA文庫的製備是下一步工作的關鍵步驟代定序（NGS）。自動化的DNA文庫製備為建構高產量定序文庫提供了一種簡化的方法同時盡量減少實際操作時間。在這裡，我們描述海百合DNA製備自動化的效率裝備(伊利，CatNo。20018705)，KAPA超級試劑盒(羅氏®. , CatNo.7962363001)和NEBNext超II試劑盒(新英格蘭生物實驗室®. , CatNo .E7645L)在OT-2機器人液體處理平台上。

材料與方法Illumina DNA製備試劑盒、KAPA超級製備試劑盒、NEBNext Ultra II和視中心OT-2平台概述擁有專利NGS標記工作流程，利用珠聯轉座體，這不同於KAPA HyperPrep和NEBNext Ultra II工作流程-DNA末端修復和a尾的解決流程。

對於Illumina DNA準備試劑盒，使用OT-2上的雙索引適配器對DNA進行標記和標記。 DNA樣本（n=8,100 ng）量化，歸一化到一個4 nM的庫，匯集到一個多路復用的樣本，然後在一個2x75上運行在Illumina MiSeq上的流式細胞進行基因組測序。工作流程包括產生DNA準備庫Lambda（n=24）和人類基因組DNA樣本（n=8）。

對於HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA製備試劑盒，我們在OT-2上建構了抗體DNA片段（n=8,100 ng）的DNA文庫。使用的條碼來自KAPA獨特的雙索引適配器，和NEB多重雙索引II為NEBNext索引設定1。樣本被定量、歸一化，並彙集到一個4 nM的文庫中，並在一個帶有2x75的MiSeq上進行測序流路池該工作流程包括為=片段DNA（n=24）和人類基因組DNA（ n=8）產生文庫。

定序資料由Illumina公司進行解復用基本空間®根據適配器的條碼序列，並與參考基因組對齊。利用Geneious技術對此基因組的覆蓋圖譜進行了分析®主要的2021.2.21. 我們的數據顯示了較低的樣本變異性和在OT-2上使用DNA製備試劑盒製備的文庫的可靠一致性。

OT-2工作流程協定的原理圖

對於Illumina的DNA準備試劑盒，DNA和IDT®為了伊利DNA/RNA UD指數集A。 .在OT-2上進行了標記（圖1）。 A清洗步驟是必要的，以去除殘留的DNA和適配器接下來，使用具有可編程蓋子和塊溫度的OT-2甲板上熱循環器進行PCR擴增。

對於HyperPrep和NEBNext Ultra II DNA製備試劑盒，都以NEB片段酵素進行片段化。人類16分鐘，人類20分鐘基因組DNA，然後用AMPure進行清理®XP珠子(貝克曼庫爾特，CatNo。.A63881).對OT-2進行DNA末端修復/A尾跡，然後是AMPure XP珠子清理步驟、條碼或適配器連接（圖1）。使用的條碼來自KAPA獨特的雙索引適配器(羅氏，CatNo。08861919702). 對於HyperPrep和NEB多重雙索引引子集1 (NEB，CatNo。E7335L)為NEBNext Ultra II。 .

使用甲板上的熱循環器在OT-2上進行DNA擴增。

工作流程佈局Opentrons OT-2平台的佈置包括模組、實驗室軟體和DNA準備試劑（圖2）。雖然工作流程包括在OT-2上的自動移液，但需要手動幹預，在甲板上的恆溫器和磁塊之間移動樣品板，並在此期間重置移液管尖端架協議。

圖2：OT-2甲板佈局

模組，實驗室軟體，和DNA準備試劑。這個

標準化的甲板佈局與HyperPrep和其他平台共享

NEB下一個Ultra II。此工作流程在OT-2上自動移液，需要手動幹預在甲板上恆溫筆和之間移動樣品板(1)

磁性磁塊(2)，以及在運作過程中重置尖端機架。甲板佈局包括1個NEST 12井儲層，1 x 96井鋁塊，1個熱循環器上的200µl PCR板，溫度模組上的1個NEST0.1 mL PCR板(3)。模組包括一個磁性模組、溫度模組、熱循環器模組，以及P20和P300 8通道移液管。

結果DNA文庫擴增使用PicoGreen檢測DNA文庫®在一個量子位元®4.用螢光計測定濃度。 CV（變異係數為標準差除以平均值）。所有文庫的最終洗脫體積均為30µL。對於使用Illumina準備的庫DNAPrep（n=8,100ng）的CV為10.7%（n=24,100 ng）的CV為16.6%（表1A）。為文庫使用HyperPrep製備，CV為（n=8100ng）的13.4%，（n=24100ng）的CV為17.6

. 1B)使用NEBNext Ultra II製備的文庫顯示（=8）的CV為12.1%，（=24）的CV為14.5%（表1C)。在OT-2上製備的lambda和人類DNA文庫的產量（ng/µl）、CV（%）和片段大小（bp）的比較見表2。

DNA製備文庫的小基因組定序多路復用的DNA準備文庫(n=8,100在Illumina上使用2x75流動細胞進行定序MiSeq儀器。第二批DNA準備文庫（n=24,100 ng）在OT-2上的3個單獨的欄位中進行處理，以解釋一批內的任何柱間變異性。

以DNA製備文庫的片段大小來確定在OT-2上製備的文庫的可靠均勻性（表3A-3C）。同樣，在OT-2上建構的48 kb基因組的一致定序覆蓋顯示了8倍路DNA製備文庫的一致性（表4）。

條碼平衡是準確的DNA準備樣本顯示的平均11.2%–12.31%的伊利米納DNA Prep，KAPA HyperPrep的10.6%–14.1%，NEBNextUltraII的10.5%–14.6%（圖3）.比較DNA製備試劑盒的尖端分配和OT-2方案的持續時間（表5）。

結論我們驗證了免疫DNA準備，KAPA超準備，和NEBNext Ultra II在OT-2和展示了它在下一代定序的文庫製備中的應用。我們發現，DNA Prep樣本在複製和化學中表現出低可變性，甚至樣本條碼平衡，並且高序列比對的覆蓋範圍，表明OT-2可以用來可靠地自動化製備高品質的DNA文庫。

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