使用Opentrons OT-2搭配熱振盪儀進行三種ELISA自動化流程

作者Boren Lin,PhD,Kinnari Watson,PhD

應用概述酵素免疫分析 (EIA) 或酵素連結免疫吸附測定 (ELISA) 是液體樣本中檢測目標分子(例如抗原)的常用分析工具，通常用於免疫診斷 或研究。本測定一般採用96 孔板格式，且工作流程通常包括 試劑轉移和混合，以及一些在恆定溫度下的孵育和洗滌步驟。這 些步驟均要求樣本處理高度一致性。為了實現自動化，我們使用OT-2 自動化移液工作站搭配熱振盪儀研發並測試了ELISA 全自動化的方案，該方案使用Takara Bio 公司的夾心法EIA 試劑盒檢測人類纖連蛋白(FN),Tecan 的競爭法ELISA 試劑盒檢測唾液中的皮質醇，以及Cell Sciences 的另一種競爭法ELISA 試劑盒用於定量血清樣本中的中和SARS-CoV-2抗體。

關鍵發現配備8通道移液管和熱振盪儀的 OT-2 移液工作站具備高精度自動化完成 ELISA的能力。在更高的吞吐量設定中，該協定可以用最少的操作時間處理多達96個樣本。

應用介紹酵素免疫分析 (EIAs) 或酵素連結免疫吸附測定 (ELISAs) 是一種透過 高度特異的抗體-抗原的相互作用對液體樣本的目標分子(例如 抗原)進行檢測和定量的技術。這種測定通常在96孔或384孔 板上進行，我們把抗原固定在孔板上，可以透過直接將抗原連接 到固體表面或使用預塗在固體表面的捕獲抗體來實現。透過這個過程，它能夠將抗原與樣本中其他非標靶分子分開。

夾心法 ELISA是此測定方法中最常用的形式。常規步驟如下：1、如果供應商未提供預塗該抗體的孔板，我們則需要將捕獲抗體(即與目標物特異結合的抗體)通過被動吸附的方式固定在孔板上(例如，8孔或12孔條紋組裝在與96孔微孔板讀取器相容的框架上)。 2.將待分析的樣本加入塗有抗體的板上，使目標抗原被捕獲。 3.將固定的目標抗原暴露給與酵素(例如辣根過氧化物酶或HRP)偶聯的檢測抗體。 4.加入酵素的底物，以產生可以測量和定量的訊號。

人類纖維連接蛋白(FN)EIA試劑盒 (Takara Bio,美國加利福尼 亞州聖荷西)是一種體外定量測定血清、尿液、細胞培養上清液 和其他生物液中可溶性人源 FN 的試劑盒。該試劑盒提供了足夠的試劑和材料，可用於在 OT-2 平台上進行 EIA協議的設計和驗證。

FN 廣泛分佈在細胞表面、細胞外基質和血漿中，參與細胞基質黏 附、細胞遷移、細胞形態的調控等細胞功能。 Takara 公司 的 FN EIA試劑盒採用兩種抗人源 FN 的鼠單株抗體，形成抗體- 抗原-抗體夾心複合物：捕獲抗體預塗在含8連管，檢測抗體與過 氧化物酶結合。透過將此複合物暴露於過氧化物酶的底物中，可 以產生光度訊號，其吸光度與樣本中目標物(即人源 FN) 的數量成正比。

競爭法 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 通 過 檢測訊號幹擾來測量抗原的濃度。簡而言之，目標抗原與預先塗在 孔板上的參照物(抗原)競爭與酵素偶聯抗體結合。樣本中目標抗 原的濃度越高，參考抗原與抗體結合的能力就越弱，產生的訊號 就越弱。 一些競爭法 ELISA 試劑盒，如次本研究中測試的 Tecan 公司的 Cortisol Saliva ELISA, 酶不是由抗體攜帶，而是由參照 物攜帶，參照物與目標抗原競爭與抗原-抗體作用。我們在OT-2 上進行測試另一個的ELISA 試劑是Cell Sciences 公司(美國馬薩諸塞州紐伯里港)的SARS-CoV-2 替代病毒中和檢測試劑盒， 用於測量SARS-CoV-2 感染後或對疫苗接種產生的循環中和抗體。中和抗體透過阻斷盤狀病毒融合蛋白的受體結合域(recep-tor-binding domain,RBD) 與血管緊張素轉換酶2 (angioten-sin converting enzyme 2,ACE2) 結合，抑制SARS-CoV- 2 進入細胞。該試劑盒提供預先塗抹的病毒棘蛋白RBD板，以競爭法ELISA 的形式，引入HRP- 偶聯的ACE2 與中和抗體競爭捕獲RBD。

雖然 ELISA 的設計方法有很多，但萬變不離其宗，他們都遵循相似的工作流程。 ELISA 的常規操作步驟包括試劑移液、孵育以及反覆洗滌，這些步驟可以在 OT-2 上輕鬆完成。在每個試劑步驟之間會進行連續的洗滌，以去除未結合的分子。為了防止剩餘的溶液帶到下一個試劑步驟中，把過量的液體全部吸走非常重要。 Opentrons的8通道移液管可進行高效、精準的移液處理，以滿足 ELISA 中試劑移液和洗滌的需求。此外，可以透過添加 Opentrons 溫控模組或熱振盪儀，以提升自動化功能和滿足實驗中的樣品孵育環節(例如設定為37℃以促進抗原-抗體相互作用)所需的恆溫功能。

材料與方法圖1-3顯示了在 Opentrons OT-2 上測試的三種 ELISA 的示意圖，包括試驗步驟概述和甲板佈局。

液體轉移是透過8通道移液器進行的。 ELISA 孔板使用了一個帶有 有裂縫密封的封膜 (BioChromato, 日本藤澤),這樣移液器 的吸頭可以穿過封膜，同時在孵育期間防止蒸發。然後，ELISA 板被固定在熱振盪儀上，並按照說明書的要求提供熱力和攪拌 作用(參考表1)。在完成實驗後，需要立即手動將 ELISA 孔板移至酶標儀，並在450 nm 波長處測量吸光度值。

為了測試 FN EIA 試劑盒，首先將人類血漿中的 FN 溶解在去離子水中，製備出1 mg/mL 的儲備溶液，然後進一步稀釋至500 ng/mL 並進行2倍的連續稀釋。而對於皮質醇 ELISA 測試，則 使用試劑盒提供的已知皮質醇濃度的標準品和控制液。先前已 經測試 SARS-CoV-2 抗體陽性或陰性的血清樣本將用於病 毒中和 ELISA 實驗。每個實驗在不同樣本量下的運行時間是可預估的(參考表1)。

實驗結果將 FN EIAs 在 OT-2 上處理。可以透過評估最終讀數與目標分子濃度之間的相關性以及不同實驗之間這種相關性的一致性來評估樣本處理品質。透過繪製平均吸光度 (n=3)與 FN 濃度之間的關係圖，並計算標準偏差，可以確定線性迴歸的擬合優度。

結果展現了 OT-2 在執行該試劑盒的實驗中的準確性和精密度(R平方>0.99,CV<10%) (圖4A), 和重複性(圖4B)。使用皮質醇的連續稀釋來測試OT-2上的競爭法 ELISA 。結果顯示液體處理的一致性(n=3,CV<10%),在半對數圖上呈現了試驗讀數與對數轉換後的樣品濃度之間的優秀負線性關聯(R 平方>0 .99 ) ( 圖5A), 且實驗之間具有可重複性(圖5C)。

為了檢測競爭法 ELISA 中 ACE2-RBD 結合的抑製作用，血清樣本 在 OT-2 上進行了三次處理，在酶標儀上測量吸光度，並獲得了變異係數。結果再次確認了 OT-2 液體處理的精確性 (CV<10%)(圖6)。根據廠商的說明書，實驗是有效的，因為每個控制組 的 OD450 值都在標準範圍內(陽性對照<0.3,陰性對照>0.9)。抑制率的計算公式如下：

本實驗成功檢測到先前被診斷為SARS-CoV-2抗體陽性的樣本中能夠中和 ACE2-RBD 交互作用的抗體(表格1)。

實驗總結透過使用OT-2 進行競爭性ELISA和中和抗體檢測，我們得出結論：1、在OT-2 上進行的稀釋處理和吸光度測量顯示了高度一致的結果，證實了OT-2 液體處理的精確性和可重複性。 2.根據廠商說明書的要求，實驗的控制組的 OD450 值都在有效範圍內，驗證了實驗的有效性。 3.利用實驗測量的抑制率，成功檢測到先前被診斷為SARS-CoV-2 抗體陽性的樣本中存在的中和抗體。 4.表格2的人體血清樣本確認為陽性，進一步證實了其先前 ELISA檢測的結果。綜上所述，該實驗在檢測中和抗體方面表現出優越的精確性和可靠性 ，OT-2 的樣品處理能力足以與傳統手動方法相媲美。