使用 Opentrons 蛋白質純化工作站進行基於 Ni-NTA 磁珠的蛋白質純化

作者

BO人   Lin,PhD,kin那日   Watson,PhD 1open TR ONS  lab works,Inc.

摘要本次測試研究的是在 Opentrons OT-2 自動化移液工作站上進 行基於磁珠的固定化金屬親和層析法 (IMAC) 。 我們使用PierceTM Ni-NTA 磁性瓊脂糖微珠(Thermo Fisher Scientific, USA) 測試了該方案，用於在OT-2 上提取目標蛋白(帶有His 標籤的GAPDH), 使用裂解緩衝液稀釋的重組GAPDH 蛋白、HEp-2 細胞裂解液及菌細胞製備的樣本。

關鍵發現在Opentrons 蛋白質純化工作站上可使用 Ni-NTA 磁珠進行重組 GAPDH 蛋白純化。 ■ 實驗結果證明所得蛋白為目標蛋白，具有良好的一致性和 特異性。 ■i 此方案可以處理多達96個樣品，並最大限度地減少需要手動操作的時間。

簡介蛋白質純化的目的是為了獲得高純度的穩定活性蛋白質，以供下游分析、研究或治療使用。固定化金屬親和層析法 (IMAC)利用金屬離子萃取具有基因工程標籤的重組蛋白，能夠螯合金 屬離子的勝肽鏈。鎳-三乙醇胺四乙酸 (Ni-NTA) 與瓊脂糖樹脂 或磁珠結合是常用的 IMAC 工具，用於純化多組氨酸 (His) 標 記的蛋白質。由於His殘基可以整合鎳離子(Ni?+),His 標記的蛋白對固定了 Ni2* 的載體表現出強烈的親和力。在 Opentrons 蛋白質純化工作站上使用 Pierce Ni-NTA 瓊脂糖磁珠萃取帶有 His標籤的GAPDH。

材料與方法IMAC Protocol 實驗流程概述IMAC protocol 的流程分為幾個部分：第一部分：樣品/磁珠混合物的製備。目標捕獲部分不在OT-2平台上進行。第二部分：洗滌和洗脫。具體流程如圖1所示。第一部分和第二部分都在OT-2 上執行。針對96個樣品，第一 部分運行時間為57分鐘，隨後在搖床上進行30分鐘的目標捕獲。第二部分需要78分鐘完成。

OT-2 平台上的 Ni-NTA 實驗流程第一部分和第二部分的設備佈局圖如下(見圖2)。協議的第 一部分和第二部分均在 OT-2 平台上進行，並使用磁珠純化模 塊將磁珠從溶液中分離出來。樣品處理過程中，將500 μL 人類 源 His標記的 GAPDH 溶液與12.5 μL 沉澱的磁珠混合，並在 室溫下以800 rpm 的速度孵育30分鐘。經過2 個洗滌步驟 後，目標蛋白在250 μL 洗脫緩衝液中以800 rpm 和室溫的條 件在搖床上洗脫10分鐘。取20 μL 洗脫物進行 SDS-PAGE 和 Western Blot 分析，使用單株抗-GAPDH 抗體 (Thermo Fisher Scientific,USA)和與螢光染料偶聯的二抗 (LI-COR Biosciences,USA) 進行檢測。

結果GAPDH 在重複實驗中萃取得到 一 致的樣品處理結果(透過Western blot 分析的蛋白帶訊號測定， CV=6%) ( 圖3)。部分萃取物透過使用 QubitTM 蛋 白 質 分 析 (ThermoFisher Scientific,USA) 進行定量，證明了高蛋白質產量( 圖 4A) 。 此 外 ， 使 用Opentrons 蛋白質純化工作站進行 的蛋白質純化過程不會破壞蛋白質的酶活性，這是通過GAPDH 活 性 分 析 (Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)檢 測 得 出 的 ( 圖 4B)。

Ni-NTA 介導的敲低實驗對於在細胞或組織樣本中分離 外源性表現的 His 標記蛋白質非常有用。上一個方案用於純 化 2 0 0 μLHEp-2 細胞裂解液中的 His 標 記 GAPDH。結果再次證明 His-GAPDH 成功被萃取，與非標記 蛋白的結合相比，Ni-NTA 磁珠的親和力特異性非常高 (圖5)。在大規模蛋白質生產中，常用大腸桿菌進行重組蛋白表現。透過裂解有或沒有 IPTG 誘導的 His標記 GAPDH 表現的細菌細胞來製備細胞裂解液。結果進一步確認了此方案成功地使用 Ni-NTA 磁珠進行了帶有 His 標 記 的 蛋 白 質 純 化 ( 圖 6 ) 。在這項研究中處理了96個樣本，顯示的結果僅為在96 孔樣品板的最後 一列中的8個樣品。同時，實驗結果也對不同樣本規模的運行時間進行了評估(圖7)。

結論本次研究在 Opentrons 蛋白質純化工作站上運行了一種基於磁珠的 His 標記重組 GAPDH 蛋白質純化的自動化實驗流程解 決方案。實驗證明， Opentrons 蛋白質純化工作站可以在中到高通量的設定中穩定且有效率地處理樣本，減少操作時間，同時提供符合預期的可重複性的產出。

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