Opentrons PCR 工作站自動化PCR製備反應方案

摘要隨著生命科學屆對PCR的需求正在增加。在本應用說明中，我們展示了 Opentrons PCR 工作站與市面主流的外置第三方熱循環儀相 比，能夠產生預期的PCR擴增產物的鹼基對長度。結果顯示，無論是嵌套PCR或多重PCR, 都能產生預期的 PCR擴增產物的鹼基 對長度。

簡介由於樣品製備過程中可能存在污染、技術錯誤和時間限制，複雜方案(例如巢式 PCR 和多重 PCR) 的效率和準確性難以保障。多重 PCR 實驗用於 GMO (基因改造生物)檢測、法醫學、食品分析、突變和多態性檢測、基因缺失分析、模板定量、連鎖分析以及更多應 使用。這些多重反應非常高效，可在孔槽中產生兩個或多個擴增子的產物。

巢式PCR 是另一種高度特異性的技術，可用作有用的診斷工具，用於識別生物樣本中的病原體，例如動脈粥狀硬化斑塊中的牙周病原體、轉移性乳癌細胞以及結核分枝桿菌和馬爾尼菲青黴等病毒病原體與僅需要一個擴增步驟的標準PCR 不同，巢式PCR 具有兩個步驟擴增過程。在第一個 PCR 擴增步驟中產生的 PCR 擴增子用作第二個擴增步驟的模板。這些複合 PCR 實驗可能會因最終產品的不同 而變得繁瑣和耗時。 Opentrons PCR 工作站可以自動化實現 PCR 實驗，只需要進行非常少量的手動準備工作，就可以產出穩定的一 致性結果。

材料和方法

多重 PCR 實驗步驟使用從銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌分離的基因組 DNA 進行了多重 PCR 實驗。根據先前的研究，設計了針對銅綠假單胞菌(lasl、lasR、gyrB) 和金黃色葡萄球菌(16s rRNA、clfA、mecA、Eubacterial 16S rRNA)多個位點區域特異性的正向和反向引子。每個孔預期產物的大小分別為600、700和222bp。 在 Opentrons OT-2 的平台上，在0.1 ml 96 孔全裙邊 NEST 板上準備 了20 μL的多重 PCR反應混合物，並使用設備上的熱循環儀進行擴增。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析。同時，為了比較分析， 我們也用手動準備了相同的實驗，並在第三方手動熱循環儀上運行。

巢式 PCR 實驗步驟巢式 PCR 是用於鑑定從 lambda 噬菌體分離的生物樣本中的病原體的方法。根據先前的研究，針對銅綠假單胞菌(lasl、lasR、 gyrB) 和金黃色葡萄球菌(16S rRNA、clfA、mecA、Eubacterial 16S rRNA) 設計了特異性的多個位點區域的正向和反向引子。 PCR組分提供給OT-2 平台，並轉移到0.1 ml96 孔 NEST板中。在混合和 Opentrons 熱循環模組自動密封之前，最後加入 DNA 模板。對於第二個擴增步驟，使用0.1 ml 的 NEST 孔板重複此過程，並將其密封後放置在第三方熱循環儀上。第一次擴增的擴增產 物被用作陽性對照。

PCR產物以2%瓊脂糖凝膠電泳分析。所有實驗都使用Qubit BR定量，並計算變異係數以評估擴增的一致性。

實驗結果使用Opentrons 熱循環模組在OT-2上進行自動化多重PCR實驗，運行結果顯與第三方熱循環儀相當。

多重 PCR的實驗佈局採用了 Kim 等人在2018年的研究中的方法。樣品孔位標示為綠色，陰性對照標示為藍色(見圖1)。

為了評估自動化多重 PCR 的高敏感度和特異性，在凝膠上進行PCR 產物檢測。與第三方熱循環儀產生的PCR 產物相比(圖2B), OT-2熱循環儀上產生的PCR 擴增產物不僅顯示出更清晰和明顯的條帶，而​​且長度符合預期(lasl為600bp, lasR 為700bp,gyrB 為222bp) ( 圖2A)。為了進一步證明 OT-2 的效率，使用針對金黃色葡萄球菌(16s rRNA 、clfA 、mecA 、Eubacterial 16s rRNA) 的特異性引子進行 自動化多重 PCR。預期的鹼基對長度分別為791bp、638bp、499bp 和371bp, 並在瓊脂糖凝膠上檢測(圖2C) 。 同時，使 以相同的PCR組分進行了手動多重 PCR協議，使用第三方熱循環儀進行操作(圖2)。在 OT-2上自動化和手動進行的多重 PCR都 顯示出了類似的擴增效果(圖2A、2B)。

在每個孔位上測試的銅綠假單胞菌基因組DNA 中擴增了預期長度為600、700和222 bp 的lasl、lasR和gyrB目標。 A)1-8 道顯示了在OT-2 上自動加樣和熱循環後的產物。 B)1-8 道顯示了在第三方熱循環儀上手動加樣後的產物。在每個孔位上測試的金黃色葡萄球菌基因組DNA 中擴增了預期長度為 791、638、499和371 bp 的16S rRNA、clfA、mecA和真菌的16S rRNA目標。 C)1-8 道顯示了在OT-2 上自動加樣和熱循環後的產物。 D)1-8 道顯示了在第三方熱循環儀上手動加樣後的產物。

為了驗證在OT-2 和第三方熱循環儀上產生的PCR 的精確性，分析了變異係數(CV%), 結果顯示在多重PCR 和巢式PCR 實驗中， OT-2 的CV% 值與第三方熱循環儀相比相同或較低，顯示擴增的均勻性較好(見表1)。

表1:在不同模板類型和PCR實驗中表現出高度均勻的擴增效果。 CV值(變異係數)為經過Qubit 定量後計算得出的結果，分別顯示了在OT-2 和第三方熱循環儀上進行的每個實驗的CV值。

在巢式 PCR 的佈局中，樣本孔以綠色標記，陰性對照孔以藍色標記(圖3)

設計了兩組引物，用於檢測 Lambda  模板 DNA 的500 bp 和247 bp 區域。第一次PCR 運作中檢測到了500 bp 區域，而第二次 PCR 運作中則檢測到了247bp  區域。樣本進行了三次巢式 PCR 重複實驗，然後在 PCR 運行結束後對擴增產物進行分析。

在瓊脂糖凝膠上分析了在 OT-2  和第三方熱循環儀上產生的 PCR擴增產物(圖4)。外層擴增片段的預期大小為500 bp,    內層擴增片 段為247 bp 。 PCR 擴增產物顯示出類似的產量和變異係數 (CV%)    (表1),實驗結果說明了 OT-2  的產出與手動操作和第三方設備 一致。

結論

Opentrons  PCR 工作站與第三者手動熱循環儀對比，在 PCR 擴增產物的鹼基長度方面表現出精確的擴增能力，且移液精準度高。此  外，Opentrons PCR 工作站展示了一個孔中準確進行多重 PCR 以及巢式 PCR 實驗的擴增量。