ngs二代定序步驟與流程

一、二代定序簡介1.第二代定序（Next-generation sequencing，NGS）：又稱高通量定序（High-throughput sequencing），是基於PCR和基因晶片發展而來的DNA定序技術。 2.一代定序為合成終止定序，而二代定序開創性的引入了可逆終止末端，從而實現邊合成邊定序。 3.二代定序在DNA複製過程中捕捉新添加的鹼基所攜帶的特殊標記（一般為螢光分子標記）來確定DNA的序列。

4.現有的技術平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。 5.由於在二代定序中，單一DNA分子必須擴增成由相同DNA組成的基因簇，然後進行同步複製，來增強螢光訊號強度以讀取DNA序列；而隨著讀長增長，基因簇複製的協同性降低，導致鹼基定序品質下降，目前二代最長的讀長是miseq的600bp。 6.二代定序適合擴增子定序（例如16S、18S、ITS的可變區），而基因組、宏基因組DNA則需要使用鳥槍法打斷成小片段，定序後再使用生物資訊方法進行拼接。鳥槍法：將大分子的目標DNA隨機處理成大小不同的小片段進行定序，並在後續的生物資訊分析中將這些短序列組裝成目標DNA的技術方法。傳統方法：使用限制性內切酶對目標DNA上的限制性內切酶識別位點進行切割，從而形成小片段。常用方法：使用機械法（例如超音波DNA破碎）使大分子DNA形成在一定長度範圍內分佈的短序列片段。

二、代定序的背景與特性1.2005年，羅氏推出了第一款二代定序儀羅氏454，生命科學開始進入高通量定序時代。 2.隨著Illumina系列定序平台的推出，大幅降低了二代定序的價格，推動了高通量定序在生命科學各研究領域的普及。 3.特性：通量高、讀長短

三、NGS實驗步驟1.核酸萃取與檢測2.文庫建構與文庫檢測3.上機定序

原理：從細胞中分離得到的DNA是與蛋白質結合的DNA，其中也含有大量RNA，即核糖核蛋白。利用DNA不溶於0.14mol/L的NaCl溶液而RNA能溶於0.14mol/L的NaCl溶液此性質可將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣本破碎細胞液中分開。分離得到核蛋白後，還需進一步將蛋白等雜質除去。去除蛋白質的方法有3種：①用含辛醇或異戊醇的氯仿振盪核蛋白溶液，使其乳化，然後離心除去變性蛋白質。用此方法處理時，蛋白質停留在水相和氯仿相中間，而DNA則溶於上層水相，用兩倍體積95%乙醇溶液可將DNA鈉鹽沉澱出來。 ②以十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質變性，使其與核酸分離，也可從材料中直接萃取DNA。 ③用苯酚處理，然後離心分層，一樣可以將DNA+與蛋白質分開。這時DNA溶於上層水相，蛋白變性後則停留在酚層內，吸出上層水相，加入兩倍體積的95%乙醇即可得到白色纖維狀DNA沉澱。重複使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質較徹底地除去，得到較純的DNA製品。

磁珠吸附法、過柱收集法DNA萃取步驟✱細胞裂解✱去除雜質✱回收DNA✱清洗溶解DNA

2.文庫建構與文庫檢測NGS文庫建構：DNA片段加接頭修飾的過程。以試劑盒NEBNext®Ultra™II DNA Library Prep Kit for Illumina®為例

具體步驟：①末端修飾：1.使用Tap聚合酶補齊不平的末端2.並在兩個末端添加突出的鹼基A，從而產生黏性末端（若使用Tap酶擴增，則無需末端修飾）3 .產生黏性末端的片段可以添加接頭（Adaptor）

②添加接頭：1.經過末端修飾後的PCR片段末端具有突出的A尾，而接頭具有突出的T尾，可以使用連接酶將接頭添加到DNA片段兩端。 2.NEB的接頭為特殊的鹼基U鏈結的環狀結構（可以增強穩定性），因此連接接頭後，還需要將鹼基U刪除從而形成"Y"型接頭。 3.上一步驟新增的接頭主要是為了後續PCR中作為引子擴增繼續添加文庫index和與定序平台互補的寡核苷酸序列（此外還作為定序引子Rd1 SP/Rd2 SP）.4.之所以為"Y"型開叉結構，是因為每一端接頭是兩個不互補的序列（每一端都是Rd1 SP與Rd2 SP交錯），連接酶沒有選擇性，每個接頭都是只靠突出來的T與DNA鏈接，"Y"接頭保證了每條單序列均為不同的測序引物，從而在後續PCR中可以連接不同的管核苷酸序列（P5/P7）。

③磁珠純化：添加接頭後的文庫體系中含有聚合酶、連接酶等各種酶以及輔助物質，接頭的添加也是過量的，而且由於末端的不穩定性，容易形成自連片段，鳥槍法打斷的片段中也可能有大片段存在，所以需要特殊磁珠（AMPure XP Beads）純化來去除大片段以及各種雜誌，從而獲得成功添加接頭的文庫片段。 1.原理：磁珠可以透過氫鍵等作用力來吸附DNA片段，磁珠本身不具有片段大小選擇的能力，但其儲存的buffer裡面還有20%的PEG 8000，PEG濃度越大則可以吸附的DNA片段越小。 2.注意事項：磁珠純化的時候要根據文庫片段不同嚴格控制磁珠添加量（其實就是PEG添加量）來實現片段選擇。

④PCR擴增：1.添加了接頭的DNA片段，可以使用與接頭互補的引子來擴增。 2.片段還需要添加用於區分不同文庫的特異性index，以及與定序儀晶片互補的兩種寡核苷酸序列（P5/P7）。

⑤第二次磁珠純化：1.PCR後需將產物DNA片段與聚合酶等雜質分離，因此再進行磁珠純化。 2.之後進行品質檢測，包括DNA濃度檢測、瓊脂糖凝膠電泳及片段長度檢測，完成建庫。