負擔得起的COVID-19測試使用OT-2的自動化

摘要利用Opentron的OT-2和平台，我們展示了一種高度敏感、經濟實惠的管道，用於基於pcr的SARS-CoV-2檢測。

主要發現.此管道可在所有目標上檢測到微量病毒至0.5拷貝/μLwith，≥準確率為96%，顯示OT-2的靈敏度可與其他自動化系統媲美。 .一個冠狀病毒交叉反應性小組展示了該病毒與SARS、MERS和人類冠狀病毒229E相比，SARS-冠狀病毒2檢測的特異性，NL63和OC43。 .在3小時內完成了96個樣本的病毒RNA提取，平均閾值週期（Ct）為36個，平均標準差為1.0，平均變異係數（CV）為2.8%。

介紹SARS-CoV-2引起的COVID-19世界衛生宣布全球大流行。 2020年3月11日的組織機構(1)。從那時起，那裡一直是全球對大規模發展的高度重視，高通量測試。而許多預防措施諸如社交距離和口罩強制要求等措施已在世界上許多國家得到執行，大規模檢測已被證明是最大限度地減少疾病傳播和對全球經濟和公共衛生的威脅的有力選擇。如南方的國家韓國(2)和新加坡(3)已經擴大了非凡的測試工作，並已成為遏制的模式疾病預計還會有一種可靠的疫苗，還有幾個月的時間（4個）和大量的測試選擇顯示出很高的假陰性率（5個），增加可靠的測試選項的數量是至關重要的。

在本研究中，我們舉例說明了一個簡單且可重複的方法使用Opentrons OT-2、模組和實驗室軟體的基於SARS-CoV-2 RT-PCR的檢測策略。這種自動友善的工作流程是非常敏感的，令人難以置信的實惠，並且可以對增加測試提供不可估量的幫助全球能力。

材料與方法合成SARSCoV-2 RNA對照2（Twist生物科學）和合成，合成陽性樣本。鼻基質（SNM）(6)，每個樣本包含200個μL裂解緩衝液和35 μL蛋白酶K（PK）。 SNM與Nuttada等人(6)中概述的內容類似。 (SNM： 110 mM氯化鈉，1% w/v黏蛋白從豬胃II型（Sigma M2378-100G）和10 μg/mL w/v人類基因組DNA（Coriell NA12878）在90% v/v的TE /SNMEeach樣品在室溫下孵育15分鐘進行裂解。

RNA萃取使用Promega進行®HT病毒TNA試劑盒，裂解後立即發生。在樣品中加入珠子和異丙醇後，在OT-2上暫停發生了混合盤10分鐘的關閉甲板渦旋器。一旦混合完成，OT-2每個樣品在65 μL中洗脫。 . 這個OT-2在左側使用了gen2p300 8通道移液管安裝多達10個200 μL過濾器運行，包括GEN2磁性模組和GEN2溫度模組（圖1）。總運轉時間，包括動手操作時間和裂解時間，在1小時到3.5小時之間變化（圖2）。

美國疾病預防控制中心（CDC）的引子和探針：.2019-nCoV_N1-F (GACCCCAAAATCAGCGAAAT).2019-nCoV_N1-R (TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG).2019-nCoV_N1P (TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG).2019-nCoV_N1P (TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG).2019-nCoV_N1P (TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG).2019-nCoV_N1P (FAM-CoACC-Fin NIMSA41F45-F45-F45-Fin (FT413-FCGF5) (TTACAAACATTGGCCGCAAA)•2019nCoV_N2-R (GCGCGACATTCCGAAGAA)•2019-nCoV_N2-P (FAMACAATTTGCCCCCAGCGCGCTTCAGBHQ1)•RP-F (AGATTTGGACCTGCGAGCG)•RP-R (GAKWTGG

它們是從整合DNA技術公司訂購的（IDT，2019-nCoV CDC EUA試劑盒）。 N1、N2和RNase P以建議的濃度進行預混2019-由CDCnCoV N 陽性對照(GenBank：NC_045512.2)和Hs_RPP30陽性對照均來自IDT，分別用於SARS-CoV-2陽性對照和人類RNA陽性對照。一步入門版™III RT-PCR試劑盒（Takara Bio Inc.）

在Takara或Luna®通用探針一步RT-qPCR試劑盒（NEB）以Lista、Maria Jose等人測試的建議濃度使用(7)。以下的程序是否進行RT-PCR檢測：逆轉錄結果為在55°C下進行10分鐘。初始變性是在95°C下變性1分鐘，然後在95°C下變性50次循環10秒，然後退火30秒60°C.

柏林Charite/世界衛生組織（WHO）的引子和探針：•E_Sarbeco_F1 (ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT)•E_Sarbeco_R2 (ATATTGCAGCAGTACGCACACA)•E_Sarbeco_P1 (FAM-ACACTAGCTCATCCTTACTdCGTG-QCAKA1S1(F8F)5(FK

圖1：易於採用基於SARS-CoV-2pcr的檢測管道A。此管道從合成樣品開始。在…之後將樣品重新格式化為NEST 96深井板2 mL，樣品在室溫下保存15分鐘進行裂解，然後使用視轉子GEN2磁性模組和GEN2溫度模組對OT-2進行RNA萃取。最後，在RT-qPCR機器上進行RT-PCR。 B.OT-2上的這個佈局包括GEN2p300 8通道移液管、GEN2溫度模組和GEN2磁性模組。實驗室軟體的要求包括多達10個200μL過濾頂，1個NEST 1井水庫195 mL，一個NEST2 mL深井板，兩個NEST 12井水庫15 mL，一個NEST96孔板100µL PCR全裙。總的來說，每個樣本的總人工製品成本為14.35美元。

圖2：快速完成在Opentrons OT-2上的COVID測試。準備時間和樣本重新格式化的時間在10分鐘到40分鐘之間，這取決於吞吐量。裂解的時間總是15分鐘。運行時間，描述為OT-2執行運行所需的時間，在8個樣本的37分鐘到96個樣本的2小時到38分鐘之間變化。總的來說，96個樣品可以在大約3.5小時內準備和萃取。

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