序列準備全自動微生物和人類DNA模板的文庫製備

作者雷德和金納裡·沃森

摘要Swift 2S Turbo DNA庫套件是完全自動化的，使用中心OT-2快速，放手，高為Illumina下一代定序提供的高品質文庫。主要發現.8個序列準備的DNA文庫可以在3小時內建構。 .分析了326bp和330bp的目標插入物大小人類基因組DNA。 .低PCR偏倚，顯示微生物和人類文庫的PCR重複水準為分別為0.02%和0.01%。 .在OT-2運行過程中保持高DNA覆蓋率，透過相似的reads百分比來描述對齊：微生物文庫佔95.4%，人類文庫佔96.4%。 .可靠且精確的性能視子熱循環器模組與第三方熱循環器相比，透過相似的產率為5.1ng/µland 7.36ng/µl，CVs分別為13%和14%。

介紹次世代定序（NGS）文庫製備是RNA或DNA片段的過程酶法定序用的使用NGS庫的準備正在迅速增加，為醫療保健和生命科學的研究人員提供了各種工作流程，以實現更快、更容易和更高的成本分析和解釋大型基因組資料集的有效方法(1)。 Swift 2S渦輪DNA文庫準備

支援各種樣品的文庫準備分子應用。這個自動化友善的工作流程是壓縮的，但要手動完成工作流程仍然會出現移液錯誤，需要幾個錯誤嗎幾個小時完成。在這裡，我們說明了Swift 2S渦輪文庫製備微生物的完全自動化以及人類基因組DNA。複雜的庫製備可以完全自動化的視中心OT- 2，模組，實驗室軟體，和歐米茄生物-tek標記結合®純NGS珠子。

材料與方法製備了350bp插入大小的文庫~560bp文庫使用人類基因組DNA(科里氏菌. NA12878)和Ecoli（ER2925）gDNA的GC含量分別為40和50%。每個opentronOT-2運行包含7個重複，每個運行包含5或10個PCR週期，取決於啟動輸入。使用的結紮母混合包括1：10稀釋的試劑W4以減少適配器二聚體。每個文庫都在Illumina MiSeq Nano v2 2x250試劑盒上進行定序。視轉子熱循環器模組和溫度模組用於主動冷卻主混合，索引和樣本使用Omega-Beo-tekMag-Bind®進行基於珠子的清理純NGS珠子(2)。這些模組共同允許這個複合工作流程的完全自動化（圖1）。 OT-2使用P300GEN2 8通道移液管和P50 GEN2單通道移液管進行運行E.大腸桿菌gDNA，P300GEN2 8通道移液管和P20 GEN2單通道移液管與人類gDNA一起運作。然而，我們建議P20. GEN2單通道移液管每次運行，使用3個尖端（圖1）。總運行時間，包括動手時間和機器人運行時間，約3小時（圖2）。峰值片段大小使用安捷倫2100生物分析儀fastq檔確定.

使用星系(7)中的FASTQC V0.11.9 (3)、BOWTIE2 (4)、Qualimap- BAMQC (5)和Bam覆蓋V2.4.1.0 (6)進行分析，以確定覆蓋率、插入大小、讀取與基因組對齊、GC含量和重複百分比。 BWA對齊器V1.1.4進行進一步分析。

結果文庫的產量具有很高的可重複性和可比性在同一運行範圍內的跨樣本和跨物種。 Ecoli gDNA輸入100 ng，人類gDNA輸入77 ng。 . . Ecoli文庫的工作流程包括10個PCR循環，平均濃度為20.34ng/µl7%的變異係數（CV）。人類gDNA文庫工作流程包括5個PCR週期，平均週期為. 該文庫具有可比性，平均峰片段大小為591bp，CV為7%. 人類文庫的平均峰值片段大小為569bp，CV為4%。產量和峰值片段大小CV顯示了不同井和不同物種之間的一致性（圖3）。定序指標在不同樣本和不同物種之間也具有可比性。大腸桿菌和人類文庫的平均插入物大小分別為326和330 bp，與依試劑規格納入直接定序的DNA目標長度相對應。兩個實驗都顯示了約95%的讀取映射時與參考基因組序列對齊，高DNA回收率和大小選擇始終保留每次運行，以非常低的PCR重複來說明（圖4）。 . 在Ecoli樣本（圖S1）和人類樣本（圖S2）中的一致覆蓋顯示了相同的性能和序列表示。而且單核苷酸變異（SNV）rs6061194為這進一步展示了性能（圖S3）。最後，對中心熱循環器模組的性能類似於手動第三方熱循環器(8)，在產量和CV上具有共通性。產率分別為5.1ng/µland和7.36ng/µland該端對端Opentrons庫製備系統的精度和可靠性（表1）。

結論Opentrons OT-2可以一次提供8個或更多的高品質庫，至少不到3個小時，最終減少了手動移液錯誤的風險，並節省了用戶時間。 .可重複的和一致的測序指標在微生物和人類文庫的產量、CV、插入大小、對齊、PCR重複和覆蓋方面。 .當產率和CV為時，視中心熱循環器模組的可靠和精確的性能與第三方熱循環器相比。

圖1. Swift 2S渦輪增壓工作流程和OpSwift 2STurbo DNA文庫試劑盒©協議。此佈局包括P20 GEN2單通道移液管和P300GEN2 8通道移液管。模組要求包括視中心熱循環器模組，溫度模組和磁性模組。這個實驗室器皿要求包括兩個NEST 0.1ml 96孔PCR板全裙，一個NEST深12孔儲液器，三個NEST 2ml螺帽管和中心24孔鋁塊。