應用概述隨著不斷進步的技術推動，現代分子生物學持續取得萬眾矚目的 突破和發展，包括更大規模的研究、更強大的治療方法以及全新 的研究問題。然而，儘管核酸萃取這項技術是分子生物學得以進 步的一項重要且密不可分的實驗環節，科研人員仍在沿用著幾 十年前冗長而繁瑣的程序進行核酸提取。在這樣的困局之下，自 動化解決方案應運而生。現代自動化透過引入具備穩定性和高效 運作優勢的機器設備完成標準化流程高效自動運行，自動化核酸 萃取將使生物實驗室舊有的工作方式迎來現代化。為了真正意義 上幫助科研人員達到高效研發或生產的目的，自動化系統需要達 到甚至超越高技能技術人員的表現，為下游工作流程提供高品質的樣本。
本研究旨在測試Opentrons OT-2核酸工作站作為有效自動化 磁珠基因萃取工具的性能。研究中使用了幾種研究人員和臨床醫 生常用的常見模板：人類唾液、人類口腔拭子、細菌培養和 RNA 病毒。同時，使用了業界常見的主流試劑品牌。透過產 量、CV 值和qPCR 數據進行效能評估，實驗數據將與高技能技術人員的手動操作結果進行比較。
經過研究測試，OT-2 表現優異。使用OT-2 進行提取的實驗變異 性降低，同時復現率提高，並且能在較低的成本和更快的周轉時 間下提供了類似的產量。重要的是，這些效能改進和成本節省可 以隨著吞吐量的增加而提升。因此，該測試表明，使用 OT-2 進 行核酸萃取自動化可以使實驗流程高效自動化，讓自動化核酸萃取能夠滿足高端分子生物學的高性能標準。
研究材料與方法人類唾液： 從匿名捐贈者收集新鮮唾液並儲存在15 mL 錐形管中直至使用。
口腔拭子：使用20 mm break point (Zymo@) 口腔採集拭子對匿名 志願者進行採樣，並儲存於在1 mL Zymo DNA/RNA 保護液中，室溫保存運輸，
細菌培養： 使用 One shot°TOP10 製備感受態大腸桿菌 (Thermo Fisher Scientific*) 在37°℃,225 rpm 振盪條件下在溶菌液中培養過 夜。使用前，每個樣品以2000 rpm 離心1.5 分鐘。移除上清液，沉澱物被重新懸浮於等體積的冷磷酸鹽緩衝液中。此外，對於乳酸桿菌樣品，每個樣品使用約1×107拷貝/μL的 Lactobacillus plantarum(ATCC°8014MINIPACKTM)。
病毒：由於2020年3月COVID-19 全球大流行開始(1),病毒 RNA 試劑盒中使用了的合成 SARS-COV-2 RNA Control 2(Twist Biosci- ences), 每個樣品10拷貝/μL。
內部對照：依照 Panpradist、Nuttada 等人(2)中所述使用和創建合 成鼻樣基質(SNM)。 SNM 的配方為：110 mM NaCl、1%w/v來自豬胃類型I的黏蛋白(Sigma M2378-100G)和10 μg/mL w/v 人類基因組DNA(Coriell NA12878), 混合體積為TE/SNM的90%。每個病毒樣本使用50 pg/μL的 SNM。
試劑盒：本研究中選擇了來自不同品牌的 DNA、RNA 和病毒 RNA萃取試劑盒(參見表1)。總共檢驗了7個試劑品牌的13種試劑盒。
表1:本研究所檢驗的萃取試劑。 在七個知名試劑品牌中，有兩種DNA萃取試劑盒、四種RNA萃取試劑盒和七種病毒RNA萃取試劑盒，均可在OT-2上自動化操作。
萃取： 在自動化檢測之前，我們對每個 DNA 和 RNA 萃取試劑及 模板進行了手動測試，以取得手動測試基線濃度。每個模板在每 種試劑中進行7次重複測試，並配備1 個陰性對照樣本。本次研 究在 Opentrons 平台上進行了自動化核酸萃取。對於 DNA 和 RNA 萃取試劑，每個樣本進行了7 次萃取。對於病毒RNA 萃取試 劑盒，包括了22 個具有相同的 SARS-CoV-2 和 SNM 模板的樣本 本。每個 OT-2 運行中都包括1個陰性對照樣本(nuclease-free H2O) 。 OT-2 的設備組裝了 GEN2 磁珠純化模組、p300 多通道 移液管和選購配的 GEN2 溫控模組，對於 RNA 實驗來說，為確保 更好的實驗效果，建議配備溫控模組。根據不同的試劑盒，需要 使用大約14盒300 μL 吸頭，1 個 NEST 的單孔儲液器，1 個NEST 2 mL深孔板，2個 NEST12 孔儲液槽和1個PCR 孔板。
引子：疾病管制與預防中心(CDC)的引子和探針：
2019-nCoV_N1-F(GACCCCAAAATCAGCGAAAT)2019-nCoV_N1-R (TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG)2019-nCoV_N1-P(FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1)2019-nCoV_N2-F(TTACAAACATTGGCCGCAAA)2019-nCoV_N2- R(GCGCGACATTCCGAAGAA)2019-nCoV_N2-P(FAMACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-BHQ1)RP-F(AGATTTGGACCTGCGAGCG),RP-R(GAGCGGCTGTCTCCACAAGT)RP-P (FAM-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1)
CDC 引子和探針訂購自從Integrated DNA Technologies公司，又稱IDT (2019-nCoV CDC EUA試劑盒)。 N1、N2 和RNase P以CDC 建議的濃度進行預混。 16s 引子：Forward (CCTATAAGACTGGGATAACTTCGGG)Reverse (CTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCG)16s 引子從IDT 訂購，於IDTE 1XTE 溶液 pH:8.0(DT) 中重懸，稀釋至10uM 的工作濃度。
定量測量： DNA 和 RNA 樣本的濃度可以使用 Qubit 4.0 FluorometerM(Thermo Fisher)進行定量測量。
此外，所有樣本均在 PCR max ECO48 實時 PCR 系統上進行 qPCR 定 量。 RNA 樣本使用Luna°通用探針一步式 RT-qPCR 試劑盒(NEB) 進行 測試，濃度由 Lista 、Maria Jose 等人測試(3)。 進行以下程序：在 55℃下進行逆轉錄10分鐘。初始變性在95℃下進行1 分鐘，然後進 行50個循環，即在95℃下變性10秒，並在60℃下退火30秒。使用 Luna Universal qPCR Master Mix (NEB)以製造商建議的濃度對DNA樣 品進行測試。使用以下程序：初始變性在95℃下進行60秒，隨後變性和延伸分別在95℃和60℃下進行15秒和30秒，持續40個循環。
實驗結果透過 qPCR 和螢光計分析測量， OT-2 萃取的核酸數量接 近，核酸樣本的 一 致性更高。
OT-2 經過了符合EUA 標 準 的性能測試，可以與多種qPCR 核提取試劑盒 一 起使用。
使用九種常用的萃取試劑盒處理人類唾液和植物乳桿菌細菌培養 物，並使用兩種常見的 qPCR 標靶進行 qPCR 分析： RNase P 用於 唾液樣本，16s 用於細菌樣本。使用六個試劑盒處理大腸桿菌培養物並使用螢光分析進行分析。
產量透過qPCR 中的循環閾值(Ct) 和螢光計中所得的ng/μL進行評估。 一致性則透過Ct值的變異係數 (CV) 進行評估。
Ct值反映了樣品跨越高於背景訊號的閾值所需的複製週期量，因此 它們傳達了數量的倒數測量。對於這些目標，在此類樣品中，25-35的 Ct 值較為可靠。
透過所有萃取試劑盒進行檢驗測試，使用OT-2自動化系統進行核酸 萃取純化可以得到具有較低CV 和可比較產量的Ct值(見圖1和表2)。熟練的技術人員和OT-2回報的平均Ct值為25-35。
手動處理的CV 值為1.41-4.8, OT-2 的CV 值為1.2-2.6。熟練的技術 人員和OT-2提供了可比較且一致的24-26 ng/μL的產量。這些結果表明， OT-2能夠在提高一致性和重複性的同時提供高產量。
圖1:顯示自動萃取的產量變異較小，且萃取純化產量可媲美手 動處理的結果。
在與新冠病毒相關的測試中，使用合成的 SARS-CoV-2 樣本和七種 常用的萃取試劑盒進行了qPCR。 我們使用了 SNM 中的人類基因組 DNA 作為內部對照，使用CDC 的 SARS-CoV-2N1 和 N2 引子進行定量分析，同時使用 CDC 的 RP 引子作為陽性對照。
這項測試旨在評估使用不同萃取試劑盒在 OT-2 上進行新冠病毒 qPCR 分析的性能。透過使用合成的 SARS-CoV-2 樣本以及內部對 照和陽性對照，可以判斷 OT-2 在檢測病毒基因組的準確性和可靠性。
qPCR 性能的評估是基於 PCR 檢測緊急使用授權 (EUA) 標準。 為了滿足 EUA 標準， 一個測試必須達到95%的擴增效果，也就是說，在qPCR 中，95%的樣本必須產生可偵測的N1和N2訊號。
在這種性能評估中，我們也對 qPCR Ct 值進行了評估。對於這些目標，在這類樣本中，標準 Ct值應該在30-40之間。
根據表格 3 的結果，OT-2 幾乎在所有試劑盒上的表現都通過了 EUA 標準。除了兩個由於裂解緩衝液過度黏稠導致妨礙了萃取過程 的試劑盒只有91%的測試結果合格。並且，在所有被測試的試劑中， 樣本結果均達到了31-39的標準 Ct 值。這些結果表明，OT-2 系統可以與各種品牌的試劑配對使用，並達到臨床標準。
為了測試OT-2 系統的吞吐量和速度，我們使用了13種熱門試劑盒 進行了RNA 和DNA 萃取，並覆蓋了不同長度。為了全面評估不同吞 吐量下的速度，測試了每批8、24、48和96個樣本的情況。以從原始樣本到純化核酸所需的時間來衡量實驗結果。
在這些萃取試劑方案中，OT-2 系統在各種試劑盒和長度下實現了 快速萃取的結果。在最短的協議中，處理8 個樣本只需要25 分 鐘，在最長的協議中，處理96個樣本不到5小時(圖2)。對於8 個樣本的處理時長， OT-2 在13種試劑盒中平均處理時間為52分 鐘。而在96個樣本的情況下， OT-2 在13種試劑盒中平均處理時間 為2小時45分鐘。這些結果表明， OT-2系統可以將其高效能與高吞吐量結合，顯著改善提取工作流程。
表2:這個表格展示了使用手動和自動處理 方法進行的不同萃取試劑盒在產率和精確 性方面的可比性。表格左側顯示了平均變化 異係數 (CV) 和循環閾值 (Ct)。
表3:這個表格說明了使用SARS-CoV-2 病毒測試的品管規範，展示了OT-2 自動化的廣泛適用性。使用7個不同品牌的7種病毒試劑盒在OT-2 上進行自動化處理後，每種試劑盒 (n=22) 中有超過96%的樣本合格。
圖2:展示了OT-2 自動化移液工作站的甲板佈局和運行時間，適用於最多96個樣品。 (A)對應96個樣品通量的RNA和DNA提取的OT-2甲板佈局，使用Opentrons 提供的實驗室耗材。 (B)RNA 和DNA 萃取協議中8個、24個、48個和96個樣本的運行時間。
研究思考OT-2 核酸萃取工作站從有機和合成原始模板中提供了優質的 RNA 和 DNA 樣本。透過 qPCR 和螢光測試發現，此自動化系統產生的 產出與由高技術水平操作人員執行的手動結果相當，並且在實驗復 現率和精確性方面超過了手動操作的性能。研究表明，OT-2 成功 地達到了滿足緊急使用授權 (EUA) 標準級別性能的要求， qPCR 信號檢測的成功率超過了95%。時間測試顯示，OT-2 處理8個樣 品的時間不到1小時，對於96個樣品的處理時間不到3 小時，這是針對具有不同協議長度的試劑盒的平均值。事實上，使用最快的 試劑盒，OT-2 處理8個樣本只需要25分鐘，處理96個樣本只需1個半小時。
應用總結●對於中等通量的實驗室來說，光是節省的時間就足以讓OT-2在不到6個月的時間內回本。
●OT-2每次處理24個樣品的萃取可節省3.5小時的人工操作時間。與手動操作相比，更高的吞吐量帶來更好的精確性、減少的變異性和提高的可重複性。
●這種高性能可以促進更好的品質控制，減少下游資料的變異 性。此外，消除了繁瑣的人工操作程序可以減少錯誤，並降低因為使用昂貴試劑重複運行程序而產生的成本。
這些測試都是在具有臨床和實驗室意義的多個樣本以及各種不同的萃取試劑盒中進行的。 OT-2 的靈活性使其能夠適應各種協議、試劑和樣本類型，以持續提供優質的結果。
