利用甲板上的加熱器搖震模組實現SARS-CoV-2的中和抗體的自動化

摘要檢測SARS-CoV-2中和抗體的可靠血清學檢測是公共衛生和臨床目的的有用工具。用於檢測中和抗體的酵素連結免疫吸附試驗（ELISAs）已從FDA頒發了緊急使用授權（EUA）。除了傳統的elisa抗體（如RBD）抗原偶聯磁珠基elisa被固定在96孔板的表面，已成為具有幾個優點的替代方法。我們有開發了一種基於珠子的ELISA，用於檢測SARS-CoV-2中和抗體。這種方法需要單獨的儀器來執行主要步驟，如液體轉移，清洗和搖晃。在OT-2平台上簡化了該實驗磁模組和加熱器搖振器，一個協議設計和檢測，以處理收集自COVID-19患者的血清樣本。從ACROBio系統公司獲得的RBD偶聯磁珠也進行了測試並對使用相同的協議進行了比較。

主要調查結果配備了磁性模組和加熱震器模組的OT-2展示了對SARS-CoV-2進行珠狀elisa的能力中和性抗體檢測精度較高。在更高的吞吐量設定中，該協議可以用最少的動手時間處理多達96個樣品。

介紹例如，在識別出病毒成分後，細胞介導的免疫反應會觸發針對病毒抗原的中和抗體的分泌存在核衣殼(N)蛋白和刺突(S)蛋白治療嚴重急性呼吸系統綜合徵冠狀病毒2（SARS-CoV-2）。抗體檢測可用於檢測由於病毒感染而導致的血清中這些中和抗體的存在，提供解決人群或過去SARS-CoV-2感染的信息，以更好地了解SARS-CoV-2的流行病學。這些測試是在臨床試驗中確定疫苗效力的常用工具以及在大規模接種疫苗之後。抗體測試通常使用酶印免疫吸附試驗（ELISA），一種技術它可以檢測和量化目標分子抗體)通過高度特異性的抗體-抗原相互作用。對於一個典型的夾層ELISA用於抗體檢測，第一步是將SARS-CoV-2抗原附著在固體表面96孔或12孔的條紋，它們可以組裝在一個與96孔酶標儀相容的框架上。然後這些樣本被添加到井中，以及抗sars-CoV-2抗體透過與抗原結合而捕獲並固定。檢測抗體，通常是一種能識別人類IgG並攜帶辣根的抗體使用過氧化物酶（HRP），並在酶的底物的存在下，產生一個比色信號並且可以被測量和量化。吸光度與樣本中抗sars-cov-2中和抗體的含量成正比。或者，磁珠也可以作為elisa中的固體表面。其優點包括一個增加的在整個樣品處理過程中，可用的表面積和珠子的均勻分佈，可以實現更快速和靈敏的檢測低分析物濃度。我們開發了一種基於珠子的ELISA，用於檢測SARS-CoV-2病毒的中和抗體。此檢測方法利用了SARS-CoV-2的受體結合域（RBD）S蛋白作為捕獲抗原，賽默費雪herDynabeads（沃爾瑟姆，MA，USA）作為固體表面。儘管檢測設計多樣，elisa通常遵循類似的工作流程。一般步驟包括試劑轉移、孵育和重複洗滌。基於珠的elisa程式需要單獨的儀器來執行這些步驟，這可能在Opentrons OT-2平台上自動化磁性模組和加熱器振動器。我們開發了一個簡化檢測方案，以避免多種儀器的需要，並減少實際操作時間。此方案也使用ACROBio系統公司的RBD偶軛磁珠（Newark，DE，USA）進行驗證，以確認OT-2樣品處理的品質。

材料與方法在視中心OT-2上測試的ELISA示意圖，完成分析的步驟大綱，以及甲板佈置圖（圖1）將60 μg SARS-CoV-S-2S蛋白his標記RBD結合製備RBD偶聯珠（ acro生物系統公司，紐瓦克，DE，美國）至5毫克迪納比德（賽默費舍爾，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國），超順磁性球形聚合物粒子為磁分離生物材料，然後儲存在2.5 mL的封閉緩衝液中。相同的協議也是透過使用市售的RBD進行測試的嗎美國生物系統的預塗層珠(36 μg RBD每毫克珠子）。人類抗sars-cov-2S1抗體作為標準抗體和小鼠單株抗人抗體以HRP偶聯作為檢測抗體的IgG Fc購自細胞科學公司（紐伯里波特，MA，美國）和Abcam公司（劍橋，英國），定制的檢測緩衝液分別由. 特諾瓦（霍利斯特，加利福尼亞州，美國）。液體轉移由8通道移液管進行。 ELISA板被放置在磁模組上，並手動移動到加熱器模組如果需要攪拌。本研究獲得了先前檢測為SARS-CoV-2抗體陽性或陰性的血清樣本。實驗完成後，立即以比色平板儀在450 nm波長下測定每個樣品的吸光度。的運行時對不同樣本量下的每種檢測方法進行了估計（表1）。

結果為了產生測試的標準曲線，在OT-2上，用50 μL的RBD偶聯珠子懸液進行檢測轉移到96孔2 mL深孔板的每個孔中，預先裝有連續2倍稀釋的人抗-SARS-CoV-2 S1抗體，檢測方法見材料與方法。測量了吸光度，並進行了劑量反應曲線繪製。結果表明，OT-2進行該檢測的精度（CV<10%）（圖2A），並且在100 ng/mL到ng/mL之間的檢測讀數與抗體濃度之間存在極好的線性關聯12.5 ng /mL（r平方>0.99）（圖2B）。

來自宏宏生物系統的RBD預塗層珠然後重組（每mL阻斷緩衝液1mg珠子），並在OT-2上使用相同的方案進行測試。製備連續2倍稀釋的人類抗sars-cov-2S1抗體，並暴露於20 μL麵包懸浮液中。這些數據被用於繪製劑量-反應曲線，以便進一步分析。 OT-2上樣品處理的一致性（CV<10%）（圖3A）和檢測讀數與抗體濃度的線性關係均得到了證實（100 ng/mL至6.25 ng/mL，r平方>0.99）（圖3B）。

為了進行基於珠子的ELISA，以確定SARS-CoV-2 S1中和抗體的水平，該方案設計用於RBD偶聯珠子的製備房子或美國生物系統公司的RBD共軛麵包是用於處理之前由傳統的、fda認證的ELISA檢測的血清樣本（陽性： *）。結果再次顯示了OT-2液體處理的精確度（CV <為10%）和抗體濃度根據圖4所示的標準曲線得到。

對OT-2抗體的抗體中和試驗

在OT-2上的基於珠子的ELISA

結論基於珠的elisa可以在配備磁模組和的OT-2平台上成功進行加熱器振動器模組。結果顯示優良的樣品處理質量，該方案適合處理最少的多達96個樣品實際操作時間。