免疫沉澱(Immunoprecipitation, IP)

需要免疫沉澱的工作流程

• 蛋白質-蛋白質交互作用研究：鑒定和驗證與相關蛋白質相互作用的蛋白質。
• 翻譯後修飾分析：富集具有特定修飾（如磷酸化或泛素化）的蛋白質。
• 功能測定：在受控環境中研究蛋白質或蛋白質複合物的活性。

免疫沉澱的最佳方法

免疫沉澱（Classic Immunoprecipitation, Classic IP）

從複雜混合物中分離出特定蛋白質，用於研究其特性、翻譯後修飾或進一步分析。

1. 使用裂解緩衝液裂解細胞以釋放蛋白質。
2. 將針對目標蛋白質量身定制的特異性抗體附著在珠子（瓊脂糖或磁性）上。
3. 細胞裂解液與抗體-磁珠複合物孵育，使目標蛋白質結合。
4. 使用洗滌緩衝液洗去非特異性結合的蛋白質。
5. 然後使用洗脫緩衝液將目標蛋白質從珠子上洗脫下來。
6. 使用離心機或磁力架從裂解液中分離出與抗體珠結合的蛋白質。

免疫共沉澱（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）

從複雜的生物樣本中分離出主要蛋白質及其潛在的相互作用夥伴，從而研究蛋白質與蛋白質之間的相互作用。

1. 細胞裂解以釋放蛋白質。
2. 將針對原生蛋白量身訂製的特異性抗體附著在珠子上。
3. 細胞裂解液與抗體-珠子複合物一起孵育。
4. 在此步驟中，與原生蛋白相互作用的蛋白質會發生共沉澱。
5. 非特異性結合的蛋白質會被洗去。
6. 原生蛋白及其相互作用蛋白被洗脫。
7. 使用離心機或磁力架分離與抗體珠結合的蛋白質。

串聯親和純化 (Tandem Affinity Purification, TAP)

實現蛋白質複合物的高純度純化，尤其適用於研究低豐度或瞬時蛋白質-蛋白質相互作用。

1. 對感興趣的蛋白質進行基因改造，使其包含雙標記系統。
2. 對錶達這種修飾蛋白的細胞進行裂解。
3. 首先將裂解液與與第一個標籤結合的珠子孵育，分離出蛋白質。
4. 使用特定的蛋白酶將第一個標籤裂解掉。
5. 使用與第二個標籤結合的珠子進行第二輪純化。
6. 經過這步驟後，蛋白質複合物被洗脫出來，純度很高。
7. 使用離心機分離與珠子結合的蛋白質。

為什麼免疫沉澱很困難：

• 特異性問題： 蛋白質與珠子或抗體的非特異性結合會導致假陽性。
• 靈敏度問題： 低豐度蛋白質可能無法有效吸附，導致假陰性。
• 維持蛋白質相互作用： 有些蛋白質與蛋白質之間的相互作用是瞬時或微弱的，因此在 IP 過程中捕獲並維持這種作用具有挑戰性。

如何實現免疫沉澱過程的自動化：

• 液體處理工作站： 這些工作站可自動添加和移除溶液，確保移液的一致性和精確度。
• 磁珠分離： 自動化平台可處理磁珠分離，減少操作時間並提高一致性。
• 整合系統： 有些平台將樣品製備、IP 和下游分析（如質譜）整合到一個工作流程中。

免疫沉澱自動化比手動移液的優勢：

• 一致性和可重複性： 自動化減少了人為錯誤和可變性。
• 通量： 自動化系統可同時處理多個樣品，提高效率。
• 降低污染風險：盡量減少人工操作，降低樣品污染的幾率。
• 最佳化方案： 自動化系統通常有最佳化的操作程序，可確保最佳結果。