Sanger測序的原理及步驟

Sanger測序，又稱為雙脫氧鏈末端合成終止法，它基於DNA複製的自然過程，透過巧妙地引入鏈終止劑，使得DNA鏈在合成過程中隨機終止，從而產生一系列長度不同的DNA片段。這些片段經過電泳分離後，形成特定的條帶模式，科學家正是透過這些條帶的位置和順序，解讀出DNA的精確序列。

Sanger測序的原理及步驟

一、原理Sanger測序的基本原理是基於DNA聚合酶在DNA模板上合成一條新的DNA鏈的過程。在這個過程中，透過加入特殊設計的二進位脫氧核苷酸三磷酸酯（ddNTPs），當新鏈中遇到這種特殊的核苷酸時，DNA聚合酶會停止合成。由於ddNTPs在5'和3'位置都不含羥基，無法與下一個核苷酸形成磷酸二酯鍵，從而終止DNA鏈的延伸。透過測定這些停止的位置，就可以確定DNA序列。

二、步驟1、DNA模板準備：將待測序列的DNA分離成單鏈，並在單鏈的3'端加入一小段已知序列的引物，使其與單鏈DNA互通。 2.反應體系設定：將DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸（dNTPs：dATP、dGTP、dCTP、dTTP）以及低濃度的ddNTPs加入反應體系。 ddNTPs作為鏈終止劑，每種ddNTPs分別對應A、G、C和T的終止。 3.鏈延伸與終止：在引子的引導下，DNA聚合酶以鹼基配對的方式添加dNTPs進行鏈延伸。當遇到ddNTPs時，鏈延伸停止，形成一系列長度不同的DNA片段。 4.電泳分離：透過電泳將反應產物分離，不同長度的DNA片段依大小順序排列。 5.螢光檢測：將電泳分離的DNA片段放入自動定序儀中，儀器根據DNA片段長度的不同記錄下每個ddNTP產生的螢光訊號。 6.序列重建：根據螢光訊號的峰值和順序，利用電腦軟體重新建構原始的DNA序列。

三、特性1、讀長較長：Sanger定序的讀長通常在800~1000bp之間，相較於其他定序方法，能夠一次讀取較長的DNA序列。 2.準確率高：由於Sanger定序是基於DNA聚合酶的合成過程，具有較高的鹼基讀取準確率。 3.結果直觀：定序結果可以直接透過電泳圖譜和螢光訊號來解讀，直觀易懂。

四、應用Sanger測序在人類基因組計畫中發揮了關鍵作用，並且至今仍被廣泛用於獲取高度準確且可信賴的測序數據。其應用領域包括但不限於：1、基因研究：用於確定基因的精確序列，研究基因的結構和功能。 2.疾病診斷：透過定序特定基因的序列，可以診斷某些遺傳性疾病。 3.藥物研發：了解藥物標靶的序列訊息，有助於藥物的設計與研發。 4.法醫學：在DNA指紋分析、親子鑑定等領域有廣泛應用。

五、限制儘管Sanger定序具有諸多優點，但也存在一些限制：1、通量低：一次只能定序一個或少量DNA片段，對於大規模定序計畫來說，效率較低。 2.耗時長：定序過程需要較長時間，包括DNA萃取、文庫建構、定序和資料分析等步驟。 3.成本高：由於定序過程和所需試劑的複雜性，Sanger測序的成本相對較高。

Sanger測序作為一種經典的DNA定序方法，在基因研究、疾病診斷、藥物研發和法醫學等領域具有廣泛應用。然而，隨著高通量定序技術的發展，Sanger測序在某些方面已逐漸被取代。

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