兩種用於 SARS-CoV-2 檢測的自動化低成本 RNA 萃取方案的評估

背景

已經評估了兩種用於從鼻咽拭子中高通量提取 RNA 以檢測 SARS-CoV-2 的自動化內部協議。

方法

在 10 天內收集了 141 個 SARS-CoV-2 陽性樣本。內部協議基於磁珠提取，設計用於Opentrons OT-2（OT-2_內部）液體處理機器人或MagMAX ^TM Express-96 系統（MM_{內部）。兩種協議均與使用 MagMAX} ^TM系統（MM_試劑盒）的商業試劑盒並行測試。核酸萃取效率是根據 SARS-CoV-2 DNA 陽性對照計算的。

結果

在檢測陽性樣本方面，內部方案和商用試劑盒之間沒有發現顯著差異。 MM 試劑_盒效率最高，儘管_{內部 MM 試劑盒}的平均 Ct 值低於其他兩種試劑盒。與商用試劑盒相比，內部方案每萃取 96 個樣本可節省 350 歐元至 400 歐元。

結論

所述協議利用易於取得的試劑和開源液體處理系統，適用於高通量設施中的 SARS-CoV-2 檢測。

引用： Lázaro-Perona F、Rodriguez-Antolín C、Alguacil-Guillén M、Gutiérrez-Arroyo A、Mingorance J、García-Rodriguez J 等人。 （2021）評估兩種用於 SARS-CoV-2 檢測的自動化低成本 RNA 萃取方案。 PLoS ONE 16(2): e0246302。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246302

編輯： AM Abd El-Aty，埃及開羅大學

收稿日期： 2020 年11 月5 日；接受日期： 2021 年1 月15 日；發表日期： 2021 年2 月16日

版權所有： © 2021 Lázaro-Perona 等人。這是一篇開放取用的文章，根據知識共享署名授權條款分發，允許在任何媒體中不受限制地使用、分發和複製，前提是註明原作者和來源。

資料可用性：所有相關資料均在論文及其支援資訊檔案中。

資金：作者未收到此項工作的特定資金資助。

競爭利益：作者已聲明不存在競爭利益。

介紹

SARS-CoV-2 疫情要求大規模使用 qPCR 檢測，以發現陽性病例並追蹤接觸者，從而阻止社區傳播。在 qPCR 檢測之前，通常需要對臨床樣本進行 RNA 萃取 [ 1-4 ]。考慮到每天檢測的樣本數量，大多數機構無法採用手動 RNA 提取方法，因此，自動化系統被廣泛用於此任務 [ 5-7 ] 。自動化系統的缺點是，它顯著增加了最終成本，這可能會阻礙某些地區的大規模檢測。此外，由於需求增加，萃取試劑的庫存短缺導致診斷嚴重延遲。

本文介紹了兩種低成本的自動 RNA 萃取方法。第一種方法使用OT-2 系統（Opentrons，紐約州紐約市，美國），這是一種能夠自動執行自行設計方案的開源液體處理機器人；第二種方法使用快速且易於使用的核酸萃取儀MagMAX ^TM Express-96 系統（Thermo Fisher Scientific，麻薩諸塞州沃爾瑟姆，美國）。後者可在 30 分鐘內提取多達 96 個樣本，但需要事先手動分配試劑、磁珠和 96 孔板中的樣本，這會增加 30 分鐘。作為替代方案，OT-2_內部方案可以完全自動化地在 104 分鐘內處理多達 48 個樣本。

方法

樣本採集

在十天內，收集了 141 份連續的 SARS-CoV-2 陽性鼻咽拭子，這些拭子帶有病毒運輸培養基（西班牙巴塞隆納 Deltalab），並儲存在 4°C 下。處理前，將500 μL 病毒培養基和500 μL 4M 異硫氰酸胍(GTC)（德國希爾登Qiagen）與5 μg/mL 載體RNA 混合，使樣品失活，然後將樣品在80°C 下加熱2 分鐘，並短暫渦旋混合。

設備和試劑

核酸自動萃取採用兩種系統：MagMAX ^TM Express-96 深孔磁粉處理器（King Fisher Instrument，Thermo Fisher Scientific，美國麻薩諸塞州沃爾瑟姆）和開放式系統OT-2（ Opentrons，美國紐約州紐約），配有GEN1 磁模組（Opentrons，美國紐約州紐約）和內部協議。兩種系統均使用 MagMAX™ Express 96 板和深孔板（Thermo Fisher Scientific，美國麻薩諸塞州沃爾瑟姆）。

核酸萃取採用三種方法：1）根據製造商的說明，使用MagMAX ^TM和商用MagMAX CORE 核酸純化試劑盒(MM_{試劑盒)（Thermo Fisher Scientific，美國麻薩諸塞州沃爾瑟姆）；2）OT-2 系統採用通用試劑（OT-2內部}），例如乙醇（Emsure®，Merck KGaA，德國達姆施塔特）、2-丙醇（Emsure®，Merck KGaA，德國達姆施塔特）、洗脫緩衝液（Omega BIO-TEK，美國喬治亞州諾克羅斯）、無核酸酶水（Ambion ^TM，Thermo Fisher Scientific，美國麻薩諸塞州沃爾瑟姆）和磁珠（Mag-Bind® TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美國喬治亞州諾克羅斯）；3）MagMAX ^TM採用與商用試劑盒相同的協議，但使用OT-2 方法中的試劑（MM_內部）。內部協議是 Hui He 等人所描述的程序的修改版[8]。簡而言之，將滅活的呼吸道樣本以1:1 的比例與異丙醇混合，至最終體積為500 μl（_{內部OT-2）和1000 μL（內部}MM），加入40 μL 磁珠並在室溫下孵育5 分鐘。接下來，用磁鐵將磁珠拉到管的一側並棄去上清液。然後用 500 μL 新鮮製備的 70% 乙醇洗滌磁珠兩次。第二次洗滌後，棄去 70% 乙醇並在室溫下風乾磁珠。最後，將珠子重新懸浮在 100 μL 洗脫緩衝液中並再次用磁鐵分離以回收洗脫的病毒 RNA（表1）。

表 1.所評估的三個方案中所使用的步驟、試劑和體積（μL）。

協議設計與驗證

MM_試劑盒協議：

1. 準備兩個深孔板，一個深孔板每孔裝有 500μL MagMAX™ CORE Wash Solution 1，另一個深孔板每孔裝有 500μL MagMAX™ CORE Wash Solution 2。準備一個 MagMAX™ Express 96 微量滴定板，每個孔裝 90μL MagMAX™ CORE Elution Buffer。
2. 每個樣品準備 20μL MagMAX™ CORE 磁珠和 10μL MagMAX™ CORE 蛋白酶 K 的混合物（珠子/PK 混合物）。
3. 為每個樣品準備 300μL MagMAX™ CORE 裂解液和 300μL MagMAX™ CORE 結合溶液的混合物（裂解/結合溶液）。
4. 在深孔板中每孔分配 30μL 珠子/PK 混合物、700μL 裂解/結合溶液和 200μL 樣品。
5. 將所有板放入系統並執行腳本 MagMAX_CORE_KF-96。

MM_內部協定：

1. 準備兩個深孔板，每個孔加入 500μL 70% 乙醇。準備一個 MagMAX™ Express 96 微量滴定板，每個孔加入 90μL 洗脫緩衝液（Omega BIO-TEK，美國喬治亞州諾克羅斯）。
2. 在深孔板中每孔分配 40 μL 磁珠（Mag-Bind® TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美國喬治亞州諾克羅斯）、500 μL 異丙醇和 500 μL 樣本。
3. 將所有板放入系統並執行腳本 MagMAX_CORE_KF-96。

OT-2_內部協定：

1. 將 40μL 磁珠（Mag-Bind® TotalPure NGS，Omega Bio-Tek，美國喬治亞州諾克羅斯）、250μL 異丙醇和 250μL 樣本分裝到深孔板中。用移液管吹打五次混勻，室溫孵育 5 分鐘。
2. 啟動GEN1磁性模組4分鐘。
3. 收集上清液並棄去。
4. 加入500μL 70%乙醇，收集並丟棄。
5. 加入500μL 70%乙醇，收集並丟棄。
6. 風乾 4 分鐘。
7. 關閉GEN1磁性模組並加入100μL洗脫緩衝液（Omega BIO-TEK，美國喬治亞州諾克羅斯）。
8. 30秒後開啟GEN1磁性模組。
9. 90秒後收集上清液並轉移至96孔微量滴定板。

樣品輸入量是自動移液系統允許的最大量，其他試劑的量也不同，因此三種方法的輸入量不同

OT-2內部協定是根據 Opentrons 說明用 Python 編寫的。腳本已存放在 GitHub 儲存庫中

為了驗證內部核酸萃取方案的性能，使用DNA 陽性對照TaqMan 2019-nCoV 對照試劑盒v1（賽默飛世爾科技，美國麻薩諸塞州沃爾瑟姆）製作了標準、低和極低病毒載量的模擬樣本。對照試劑盒的濃度為 1 x 10 ⁴拷貝/μL。標準病毒量樣本的製備方法是將 10 μL 陽性對照與 490 μL 病毒運輸培養基和 500 μL GTC 混合。低和極低病毒量的製備方式相同，但使用陽性對照的十倍連續稀釋液。所有模擬樣本均製備三份，並與_內部OT-2 、MM_{試劑盒和內部}MM並行處理，然後使用TaqMan 2019- nCoV 檢測試劑盒v1 進行qPCR 測試。標準、低和極低病毒量的模擬樣本中陽性對照的最終濃度分別為1 x 10 ⁶拷貝/mL、1 x 10 ⁵拷貝/mL 和1 x 10 ⁴拷貝/mL。所有運行均包括陰性對照。

透過將模擬樣本中陽性對照的Ct 值(Ct _ss ) 與直接從庫存製備的陽性對照的Ct 值進行比較來計算核酸提取效率，校正量以匹配稀釋因子和每個方案中使用的初始樣本量(Ct _pc ) (R = 2 ^-ΔCt = 2 ^-(Ctss-Ctpc) )。

定量PCR

使用針對orf1ab、刺突(S)、核衣殼(N) 和人類RNaseP 基因的TaqMan 2019-nCoV 檢測試劑盒v1 以及作為陽性對照的TaqMan 2019-nCoV 對照試劑盒v1，依照製造商建議的qPCR 條件對SARS-CoV-2 病毒RNA 進行核酸擴增。所有 qPCR 檢測均在 CFX96 Touch 實時 PCR 檢測系統 (Bio-Rad，美國加州赫拉克勒斯) 中進行。為了減少檢測間差異，萃取的核酸樣本使用另一個 OT-2 模組自動分配到 qPCR 試紙中。

統計分析

成對比較了這三種方案。使用 McNemar 檢定來比較它們將樣本分配為陽性或陰性的表現。 Ct 值不呈常態分佈，因此使用 Wilcoxon 符號秩檢定來比較每個目標的 Ct 值。對於每個目標，僅考慮透過這三種方法擴增的樣本。使用 bootstrap 方法計算中位置信區間。

所有統計檢定均採用 IBM SPSS Statistics 24.0.0.0 軟體套件（SPSS Inc.，美國伊利諾州芝加哥）執行。

結果

萃取方案的效率

透過提取模擬不同病毒量的 SARS-CoV-2 陽性對照製備的模擬樣本，將兩種內部方案的核酸萃取效率與 MM_{試劑盒方案進行了比較。 MM試劑盒}和OT-2_內部方案成功擴增了所有具有標準病毒量的模擬樣本中的orf1ab 、S 和N 標靶。對於這些樣本，所有重複和基因的平均萃取效率為MM_{試劑盒33.9%（SD：13.8），OT-2內部}方案19.6%（SD：2.2） ，MM_內部方案16.0%（SD：5.03） 。

在低病毒量模擬樣本中，MM_試劑盒無法擴增所有樣本中的S 靶標，也無法擴增其中一個重複樣本中的N 靶標，而OT-2_內部和MM_內部檢測出了所有基因。最後，MM_試劑盒和OT-2_內部方案無法擴增極低病毒量樣本，除了一個重複樣本，其中N 基因可以透過OT-2_內部方案擴增，但MM_內部可以檢測到所有樣本中的陽性對照，其中一個樣本含有三個靶標，一個樣本含有orf1ab和 N標靶，最後一個樣本含有orf1ab標靶（S1 表）。

臨床呼吸道樣本的核酸萃取

收集的141 個陽性臨床樣本同時使用MM_試劑盒、OT-2_內部方法和MM_內部方法進行核酸萃取，並透過qPCR檢測洗脫的SARS-CoV-2 RNA。記錄每個目標的陽性/陰性結果和擴增循環閾值 (Ct)。根據製造商的說明，當三個目標區域中至少一個擴增且 Ct<40 時，樣本被視為陽性。所有運行中包含的陰性對照在所有情況下均產生陰性 PCR 結果。

141 個樣本中，123 個樣本透過至少一種萃取方法檢測出 SARS-CoV-2 陽性，而 18 個樣本透過三種方法檢測均為陰性。這可能是由於樣本在採集期間降解所致，因為它們已在 4°C 下儲存了約 48 小時 [9]。依方法分類，114 個樣本使用MM_{試劑盒檢測呈陽性，111 個樣本使用內部}OT-2 檢測呈陽性，118 個樣本使用_內部MM 檢測呈陽性。成對比較發現它們檢測SARS-CoV-2 的性能沒有顯著差異（MM_試劑盒Vs OT-2_內部，P = 0.5465 ；MM_試劑盒Vs MM_內部，P = 0.3865；OT-2_內部Vs MM_內部，P = 0.0961）。 18 個樣本透過三種方法中的一些方法檢測呈陰性。這些具有較高的 Ct 值， orf1ab和 N 標靶的中位數分別為 38.68 和 38.19（在這些樣本中，S 標靶未透過任何方法擴增）。比較所有方法和標靶的配對線性迴歸和相關性分析顯示R ²值在0.85 和0.95 之間，Bland-Altman 分析顯示在整個Ct 範圍內一致性是一致的（S1 圖）。

_{在使用MM試劑盒}萃取的樣本中，43% 可偵測到三個標靶（orf1ab 、 N 和S ），在使用_內部 OT-2 提取的樣本中，49%可檢測到，_{在使用內部}MM 提取的樣本中，49% 可檢測到（圖1）。在 34%、39% 和 30% 的樣本中檢測到了orf1ab和 N 靶標，在 19%、10% 和 17% 的樣本中僅擴增了 N 靶標。只有極少數樣本因單獨擴增orf1ab標靶（6）、orf1ab + S（1）或N + S（5）標靶而被視為陽性，且沒有樣本以S 基因作為唯一的陽性標記。事實上，該檢測中的 S 標靶明顯缺乏靈敏度，且與診斷決策無關。使用OT-2_內部協議檢測到兩個或三個目標的樣本佔87%（97 個樣本），使用MM_{內部協議檢測到兩個或三個目標的樣本佔82%（95 個樣本），使用MM試劑盒}偵測到兩個或三個目標的樣本佔79% （90 個樣本）。

考慮配對樣本時，在orf1ab ( P = 0.437)、N ( P = 0.686) 和S ( P = 0.794) 標靶的Ct 值中，MM 試劑盒和OT-2 內部方案之間的Cts 沒有顯著差異( 圖2 )。與 MM 試劑盒 ( orf1ab ; P < 0.00001 , N ; _P < _0.00001 , S ; P = 0.00148 )和OT - 2內部_方案( orf1ab ; P < 0.00001, N; P = 0.00008, S; P = 0.00252)相比，MM_{內部方案在所有標靶中的Cts 確實顯}著較低。

圖2.箱線圖顯示使用MM_試劑盒、OT-2_內部方法和MM_{內部方法獲得的}orf1ab 、S 和N 目標的Ct 值分佈。 y 軸顯示擴增循環 (Ct)。顯示每個資料集上的資料點數量。

使用MM_試劑盒、OT-2_{內部試劑盒}和MM_{內部試劑盒對}orf1ab標靶的中位擴增循環(CI:95%)分別為35.53 (33.82–36.36)、35.58 (34.33–36.21) 及34.8 (33.71–35.29)。對於S 基因，中位擴增循環(CI:95%) 為30.16 (28.56–33.08)、31.32 (29.22–32.88) 和31.07 (29.36–32.90)；對於N 靶標，中位擴增循環(CI:95 %) 為34.83 (33.93–35.97)、34.64 (33.42–35.29) 和 34.28 (33.52–35.10)。

開採成本和實際操作時間

_{使用OT-2內部}協議萃取96 個樣本的核酸，總成本為107 歐元（試劑37 歐元和實驗室器具70 歐元），實際操作時間為10 分鐘，萃取時間為3 個半小時（腳本每次運行處理48 個樣本，因此必須完成兩次）。 MM_內部成本為66 歐元（試劑37 歐元和實驗室器具29 歐元），MM 試劑_盒成本為472 歐元（試劑443 歐元和實驗室器具29 歐元） 。兩種協議的實際操作時間均為 40 分鐘，提取時間均為 30 分鐘。值得注意的是，雖然96 個樣本的OT-2 協議比MM_內部協議貴40 歐元，但所需的初始投資明顯較低，OT-2 系統（包括模組和移液器）約10,000 歐元，MagMAX ^TM系統約為50,000 歐元。

討論

本文介紹了兩種低成本病毒 RNA 萃取和臨床樣本 SARS-CoV-2 檢測方法，其性能與商用試劑盒相當。儘管內部方案萃取 DNA 對照的效率低於商用試劑盒，但在臨床樣本中，整體靈敏度並未受到影響，這可能是因為內部方案使用更大的樣本起始量來彌補較低的效率。

設定 OT-2 系統進行 RNA 萃取需要對沒有經驗的團隊進行密集編程，但提供了一種經濟高效的替代方案，能夠在一次運行中提取 48 個樣本。這項工作中使用的腳本已上傳到開放存取軟體儲存庫 GitHub，在那裡可以找到許多用於這些和類似應用程式的協定。這應該有助於其他工作人員避免或減少程式步驟。該協議幾乎不需要動手時間，並且使用容易獲得的試劑。此外，與其他提取系統相比，該設備所需的投資較低，使其適用於中低資源設施。 MagMAX ^TM Express-96 是一種快速、半自動設備，每次運行能夠提取 96 個樣本。 MM_試劑盒提供用於滅活、裂解、洗滌和洗脫的試劑，可以以具有競爭力的成本用於不同的基質和樣品類型。另一方面，MM_內部協議利用該系統的半開放方法，以其他化學品取代商業解決方案，使其更具成本效益。在這兩種情況下，都必須手動準備深孔板、緩衝液和樣品，這會增加總提取時間和操作錯誤風險。這兩種內部協議的主要缺點是，當處理黏稠樣本時，黏液、高黏性多醣、白血球、紅血球、血紅蛋白、蛋白酶和含有大量細胞核酸的細胞碎屑會阻礙RNA 萃取或抑制PCR 反應[ 10- 12 ] 。為了部分克服這個問題，可以在萃取前對樣品進行加熱和渦旋或離心，但這會增加動手時間和反應時間。當使用_內部MM時，洗脫樣本在某些情況下可能含有微量的磁珠，但這不會影響 RT-PCR 反應的表現。

在這三個系統中，陰性對照在所有情況下均為陰性，顯示在這些系統中處理原始樣本時不存在交叉污染問題。不過，與非自動化系統一樣，應採取預防措施，將 PCR 前和 PCR 後操作分開。如果使用 OT-2 模組設定 PCR 後反應（例如定序），則不應使用它從樣本中提取核酸，除非徹底淨化。

研究優點和局限性

這項研究的主要優勢在於，這些方法都是在臨床微生物實驗室中以真實樣本進行測試的。方法之間的比較並不繫統，這是一個重要的限制。事實上，設計的目的是優化每個系統的結果，因此輸入是不同的。系統地探索輸入樣本量以及其他試劑量將是有益和有益的，但這超出了這項研究的目的，即比較臨床實驗室環境中系統與真實樣本的性能。

結論

總之，這裡介紹的兩種內部核酸萃取方法可有效實現 SARS-CoV-2 的高通量診斷，且成本僅為其他商業試劑盒的一小部分，且不損失靈敏度。