利用OT-2上的®DNA製備試劑盒自動製備小基因組的DNA文庫

作者馬修‧阿卡納，金納裡‧沃森博士，莫拉約‧阿德伊比博士。

介紹次世代定序（NGS）的工作流程包括使用市售軟體製備DNA文庫以及經濟有效的DNA製備試劑盒。透過使用自動化的OT-2協議來優化這個工作流程很有幫助以提高DNA文庫的製備效率。在這裡，我們描述了伊利®DNA的效率。準備工具包(Illumina，CatNo。20018705)在OT-2，機器人液體處理平台上，自動執行標記工作流程。使用OT-2的高性能能力自動化此過程提供了一個快速且健壯的工作流程，產生用於基因組定序的統一DNA準備文庫。

照明®DNA準備試劑盒和外中心OT-2平台概述伊利®專利NGS標記工作流程實現了利用珠子進行的珠上標記鏈接的轉座體。珠鏈的化學性質轉座體對DNA片段化更有效和DNA末端修復與先前溶液內標記的工作流程相比。此DNA片段使用雙索引適配器進行標記，這是一種獨特的條碼分配每個DNA片段。 DNA Prep樣本（n=8）分別為量化，歸一化到一個4nM的庫，匯集到一個單一多路復（8倍或16倍）樣品，然後在Illumina®MiSeq上的2x75流細胞上進行基因組測序。我們的數據顯示了所有數據的低變異性，PNA擴增前後測定的DNA製備樣本；條碼平衡，以及統一和高覆蓋率的定序比對。參考基因組的研究表明，使用OT-2協議的自動標記為基因組測序提供了一個高品質的DNA準備文庫。

OT-2工作流程協議的原理圖DNA和IDT®對®DNA/RNA UD指數集A的DNA和IDT®。 20027213)在孵育期間一個被稱為標記的過程，在OT-2上，如圖（圖1）所示。進行了標記清洗步驟，以去除殘留的DNA和適配器。下一個的用OT-2方法進行DNA擴增具有可編程蓋和塊溫度的甲板上熱循環器。

依照OT-2方案，進行後擴增使用AMPure(貝克曼庫爾特，貓。不a63881)根據製造商進行檢測推薦DNA Prep樣本被定量，歸一化至4nM(使用NEBNext®文庫定量試劑盒對伊利®文庫定量進行qPCR測定試劑盒，以8倍或16倍的形式匯集單一樣本，然後在伊利®MiSeq上的2x75流池上運行。

工作流程佈局OT-2平台的佈置包括模組，實驗室軟體，和伊利米納®DNA準備試劑，如詳見（圖2）。雖然該工作流程包括：在OT-2上進行自動移液，人工幹預是需要在甲板上的之間移動樣品板熱循環筆和磁塊，並在協議期間重置移液管尖端架。

DNA製備樣本的PCR擴增採用伊利®DNA製備試劑盒建構OT-2上的Lambda DNA文庫（n=8,100 ng）。分別定量前後PCR濃度（ng/uL）5個週期的PCR擴增，和DNA濃度使用Quant-iT™dsDNA高靈敏度檢測試劑盒(熱費雪科學公司，Cat。No.Q33120)在一個Qubit®上確定變異係數，即標準差除以整個樣本的平均值。 Lambda DNA樣本的PCR前平均濃度為2.92，變異係數（CV）為10.4%，5個週期後的PCR後濃度平均為28.23，CV為10.7%，見（表1）。這些結果很簡單，優化後的OT-2協議可以產生一個高品質和可靠的NGS DNA準備庫。

DNA製備文庫的小基因組定序對96個樣本的®DNA製備試劑盒(M)進行標記。用No. 20018705)製備了大腸桿菌非甲基化基因組DNA (Zymogen，Cat.. 不. 樣本（n=16,100ng）

這個工作流程在OT-2上都有自動的移液功能，需要手動操作在甲板上移動樣品板(1)和磁性磁塊(2)，以及復位在運作期間的尖端機架。甲板佈局包括1個NEST 12井水庫，1個96井鋁塊，1倍埃彭多夫熱循環器上的200ul PCR板，和一個1xNEST0.1 mL PCR板上溫度模組(3)。模組包括一個磁性模組、溫度模組、熱循環器模組，以及P20和P300多通道移液管。

兩批，第二批，E。 . 大腸桿菌DNA樣本（n=8,100 ng）在OT-2上的2個單獨的列上進行處理，以解釋列內可能出現的可變性。 E. 大腸桿菌DNA（n=16,100 ng）和Lambda DNA (n=8,100ng)被擴增、歸一化，並彙集到一個單一的多路復用（8倍或16倍）樣本中進行定序。三個DNA製備批次的定序結果為比較確定樣品產量，條碼. 平衡和覆蓋率，如（表2）所示，對DNA製備文庫觀察到統一的產量。計算了E的樣本產量。 8號試驗室的大腸桿菌含量分別為9.75和3.79. 16倍；8倍和16倍®適配器條碼的CV值分別為8.77%和6.2%，顯示8倍和16倍樣本的平衡是準確的8倍的平均11.2%-12.31%，相較之下，預期的為12.5%。對於16-plex，根據伊利®參考計算的6%的期望值為6.2%。 DNA的平均基因組覆蓋率準備了E。大腸桿菌樣本的8倍為150倍，16倍為45倍. 此外，Lambda 48kb基因組的覆蓋圖譜顯示~為7800倍，這表明對齊的序列reads水平較高（圖3）。總的來說，這表明在OT-2上建構的用於定序的DNA Prep文庫與參考計算相比顯示出一致性（圖4）。

結論我們演示了它的高性能和性能。在視中心OT-2上使用伊利umina®DNA準備試劑盒自動標記過程。我們展示了DNA Prep樣本顯示出低變異性，條碼平衡性，以及序列比對的高覆蓋率。自動化這個全面的NGS工作流程在的上OT-2將DNA文庫製備過程中的風險降至最低，同時確保基因組的DNA文庫製備品質先後順序