바이 설 파이트 시퀀싱은 DNA 메틸화 상태를 연구하는 데 가장 일반적으로 사용되고 정확한 기술 중 하나입니다. DNA 샘플에서의 황산염 처리에 의해,이 방법은 메틸화 된 시토신과 비 메틸화 된 시토신을 효과적으로 구별하여 게놈에서 메틸화 패턴의 변화를 나타낸다. 이 기술의 광범위한 적용은 특히 암, 유전자 조절 및 발달 생물학 분야에서 생의학 연구를위한 중요한 도구를 제공합니다.
1. DNA 설파이트 처리 목적 : DNA에서 메틸화되지 않은 시토신 (C)은 우라실 (U)으로 변환하는 반면, 메틸화 된 시토신은 변경되지 않았다. 치료 절차 : 바이 설 파이트 나트륨과 같은 설파이트를 사용하여 게놈 DNA를 치료하십시오.
2. 특정 프라이머 설계 원리 : 메틸화 및 비 메틸화 된 DNA의 차이를 피하기 위해 CPG 부위를 함유하지 마십시오. 프라이머 증폭 된 조각은 가능한 많은 CPG 부위를 포함해야합니다.
3. PCR 증폭의 목적 : 설파이트-처리 된 DNA 단편을 증폭시키고,이 시점에서 우라실 (U)는 PCR 동안 티민 (T)으로 전환 될 것이다. 증폭 공정 : 특정 프라이머를 사용한 처리 된 DNA의 PCR 증폭.
4. 시퀀싱 라이브러리 구성 목적 : PCR 증폭 제품을 고 처리량 시퀀싱에 적합한 라이브러리로 변환합니다. 시설 공정 : 시퀀싱 라이브러리를 구축하기위한 PCR 증폭 제품, 최종 수리, A- 테일 첨가, 시퀀싱 링커의 결찰 등.
5. 고 처리량 시퀀싱 및 시퀀싱 플랫폼 : 고 처리량 시퀀싱 플랫폼 (예 : Illumina)을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱합니다. 시퀀싱 결과 : 다수의 시퀀싱 판독 값이 얻어졌으며, 이는 DNA 단편의 서열 정보 및 메틸화 상태를 포함 하였다.
6. 메틸화 부위 식별의 생물 정보학 분석 : 시퀀싱 결과를 원래 DNA 서열과 비교함으로써, 메틸화가 발생하는 CPG 부위가 확인되었다. 메틸화 정량화 : 각 CPG 부위의 메틸화 비율, 즉 총 판독 값에 대한 메틸화에서 발생하는 판독의 비율을 계산합니다.
7. 예방 조치 전체 시퀀싱 과정에서 DNA 오염 및 분해를 피하기 위해 실험 조건을 엄격하게 제어해야합니다. 프라이머 디자인은 성공적인 시퀀싱의 주요 단계 중 하나이며 신중한 선택 및 검증이 필요합니다. 시퀀싱 결과의 정확성과 신뢰성은 DNA 품질, 시퀀싱 플랫폼의 성능 및 생물 정보학 분석의 정확도를 포함한 여러 요인에 따라 다릅니다.
설파이트 시퀀싱 공정은 DNA 설파이트 처리, 특정 프라이머 설계, PCR 증폭, 시퀀싱 라이브러리 구조, 고 처리량 시퀀싱 및 생물 정보학 분석과 같은 여러 단계를 포함한다. 이 과정은 표적 단편에서 각 CPG 부위의 메틸화 상태를 명확히하여 후속 메틸화 연구에 대한 신뢰할 수있는 데이터 지원을 제공 할 수 있습니다.
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