라이브러리 정량화를위한 ​​일반적인 방법 및 기술

NGS (고 처리량 시퀀싱)의 광대 한 분야에서 라이브러리 정량화는 시퀀싱 데이터의 품질과 깊이를 보장하는 데 중요한 링크로서 중요한 역할을합니다. 이 단계는 실험의 성공과 관련이있을뿐만 아니라 후속 생물 정보학 분석의 정확성과 신뢰성에 직접적인 영향을 미칩니다. 기술의 지속적인 발전으로 라이브러리 정량화 방법은 점점 더 다양 해지고 있으며 다양한 실험 시나리오와 요구에 적합합니다.

라이브러리 정량화

1. 라이브러리 정량화의 중요성 1. 시퀀싱 데이터의 품질 보장 : 라이브러리 정량화는 시퀀서에로드 된 DNA 라이브러리의 양이 중간 정도임을 보장 할 수 있으므로 과도한 라이브러리 농도 또는 과도한 라이브러리 농도로 인해 시퀀싱 데이터가 충분하지 않아서 불충분 한 시퀀싱 데이터를 피할 수 있습니다. 2. 각 샘플 데이터의 출력을 안정화 : 여러 라이브러리를 결합하고 시퀀싱 할 때 라이브러리 정량화는 각 샘플 데이터 볼륨의 출력을 안정화시키기 위해 시퀀싱 데이터 볼륨의 요구 사항에 따라 상응하는 어금니 양의 라이브러리를 혼합하는 데 도움이됩니다.

2. 공통 방법 1. UV 분광 광도계 (1) 원리 : 핵산 (DNA 및 RNA 포함)의 염기는 방향족 고리 구조를 포함하므로 자외선 흡수의 특성을 갖는다. 핵산의 자외선 흡수 피크는 동시에 260 nm입니다. 핵산의 순도는 A260/A280 및 A260/A230의 값을 계산하여 추정 할 수 있습니다 (280 nm 광 흡수는 일반적으로 단백질에서 나옵니다. (2) 단점 : 자외선 흡수를 갖는 구조는 핵산의 염기이기 때문에 DNA와 RNA를 구별하는 것은 불가능합니다. 따라서 DNA와 RNA는 DNA와 RNA를 모두 함유 할 때, 결정의 농도는 진정한 농도보다 높을 것이다. 2. 형광 염료 방법 (1) 원리 : 다른 유형의 핵산 가닥에 구체적으로 결합하고 특정 파장에서 광원의 여기에서 형광을 방출 할 수있는 표적-특이 적 염료를 사용한다. 그 중에서도 신호는 자유에 비해 수십에서 수백 번 증가 할 수 있으므로 배경과 구별 될 수 있습니다. (2) 수술 : 형광 염료로 시험 될 DNA 샘플을 혼합하고, 형광 염료는 DNA에 결합하여 형광 복합체를 형성한다. 이어서, 혼합물을 큐 비트 측정 기기에 넣고, 이는 레이저에 의해 형광 복합체를 자극하여 형광 신호를 방출한다. 큐 비트 측정 기기는 형광 신호의 강도에 따라 DNA 농도를 자동으로 계산합니다. (3) 장점 : 고감도, 쉽고 빠른 작동, 효율적인 탐지 프로세스 및 수십 개의 샘플을 쉽게 분석 할 수 있습니다. (4) 단점 : 샘플이 20 ~ 30 이상으로 증가 할 때,이 검출 방법은 그다지 적합하지 않으며, 결과는 일반적으로 기계 내 최종 농도로 사용되지 않습니다. 3. 실시간 정량적 PCR 방법 (QPCR) (1) 원리 : 형광 검출 기술 및 PCR 기술을 사용하여 PCR 반응 시스템에 형광 그룹을 추가하고, 전체 PCR 공정 동안 형광 신호의 변화를 실시간으로 모니터링하기 위해, 알려지지 않은 샘플의 농도는 계산된다. (2) 장점 : 특정 프라이머는 단일 엔드 또는 이중 엔드 조인트와 링커에 연결되지 않는 시퀀싱 라이브러리의 간섭을 제거 할 수 있으며 현재는 소름 끼치는 샘플을 측정하는 데 적합합니다. (3) 단점 : 높은 비용.

3. 기술 1. 핵산 오염 제거 및 피하기 : 라이브러리에 사용 된 표준의 집중력은 정량적으로 높은 수준의 표준에 따라 핵산 오염을 유발할 수 있습니다. 따라서 라이브러리 정량화를하는 실험실은 핵산을 정기적으로 제거해야합니다. 실험 기술 후, 환경의 핵산은 자외선 처리로 산화 될 수있다. 2. 라이브러리 희석 검증 : 라이브러리는 2 개의 그라디언트를 희석하고 서로 검증하는 것이 좋습니다. 지침은 10,000 회, 20,000 회로 권장됩니다. 10,000 배와 20,000 배의 CT 값의 차이는 약 1이어야하며, 이는 0.951.05 사이에있을 수 있으며, 10,000 배와 100,000 배의 CT 값의 차이는 약 3.34이며,이 두 간격이 3.23.5가 될 수 있습니다. 3. 증폭 효율의 영향 제외 : 계산 결과가 라이브러리를 두 개의 그라디언트로 희석하여 얻은 농도 편차가 크다는 것을 발견하면 부정확 한 희석으로 인한 것이거나 라이브러리의 증폭 효율이 낮아서 큰 △ CT가 발생할 수 있습니다. 이때,이 라이브러리는 4 ~ 5 10 배 희석 구배로 만들 수 있으며, 증폭 효율은 온보드의 CT 값에 따라 계산 될 수 있으므로 증폭 효율의 요인을 제거합니다.

라이브러리 정량화는 고 처리량 시퀀싱 프로세스의 핵심 링크이며 그 중요성은 자명합니다. 정량적 방법을 합리적으로 선택하고 정량적 기술을 유연하게 적용함으로써 과학 연구자들은 라이브러리의 품질 정보를보다 정확하게 파악하여 후속 생물 정보학 분석 및 과학 연구를위한 탄탄한 토대를 마련 할 수 있습니다.

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