PCR (중합 효소 연쇄 반응)은 특정 DNA 서열을 증폭시키기 위해 분자 생물학에서 널리 사용되는 기술이다. 그것이 유전자 클로닝, 돌연변이 분석 또는 유전자 발현 검출이든, PCR은 대체 할 수없는 역할을한다. 효율적이고 신뢰할 수있는 PCR 시스템을 구축하는 것이 실험의 성공을 보장하는 열쇠이며,이 과정은 일반적으로 네 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 이 기사는 모든 사람들 이이 기술을 더 잘 이해하고 적용 할 수 있도록 PCR 시스템 구성의 4 단계를 자세히 소개합니다.
1. 템플릿 DNA 준비 1 : PCR 증폭을위한 템플릿으로서 DNA를 추출합니다. 방법 : 일반적인 추출 방법에는 CTAB 방법, 식염수 용액 방법 및 상업용 DNA 추출 키트의 사용이 포함됩니다. 추출 과정에서 DNA의 완전성과 순도를 보장해야합니다. 3. 참고 : 실험 요구에 따라 PCR의 템플릿으로 적절한 DNA 농도를 선택하십시오. 너무 높은 농도는 PCR 반응을 억제 할 수 있지만, 너무 낮은 농도는 증폭이 불량 할 수 있습니다.
2. PCR 반응 시스템의 준비 1. 프라이머 : 짧은 사슬 DNA 분자는 증폭 될 DNA 단편의 각 말단을 보완하며, 이는 새로운 DNA 가닥을 합성하도록 DNA 폴리머 라제를 안내하는 데 사용된다. DNTP : A, T, C 및 G를 포함한 데 옥시 뉴클레오티드는 DNA 합성을위한 원료이다. 완충액 : PCR 반응의 정상적인 진행을 유지하기 위해 적절한 pH 및 이온 성 환경을 제공합니다. 폴리머 라제 : 예를 들어, Taq DNA 폴리머 라제는 열 내성이며 고온에서 활성을 유지하고 DNA 가닥의 합성을 촉매 할 수 있습니다. 2. 준비 방법 : 실험 요구 사항에 따라 위의 성분을 특정 비율로 혼합하여 PCR 반응 시스템을 형성합니다.
3. PCR 사이클 반응의 설정 1. 변성 : PCR 반응 혼합물을 약 95 ° C로 가열하고, 주석 DNA의 이중 가닥 DNA를 풀어 단일 가닥 DNA를 얻습니다. 어닐링 (프라이머 결합) : 반응 시스템을 적절한 온도 (보통 45 ~ 65 ° C)로 냉각시켜 프라이머를 단일 가닥 DNA의 상보 영역에 결합합니다. 연장 : 반응 시스템은 중합 효소의 최적 온도 (보통 65 ~ 75 ° C)로 따뜻해지고, 중합 효소는 프라이머에 기초하여 새로운 DNA 가닥을 합성한다. 2. 사이클 수 : PCR의 사이클 수는 증폭 될 DNA 단편의 초기 농도 및 PCR의 증폭 효율에 의존한다. 일반적으로 25 ~ 35 개의 PCR 사이클이 수행됩니다.
IV. PCR 생성물은 겔 전기 영동에 의해 분리되고 감지 될 수 있으며, PCR 생성물의 길이 및 증폭 효율은 제품의 마이그레이션 거리 및 밴드 다이어그램에 따라 판단 될 수있다. 다른 방법 : 형광 정량 PCR, 시퀀싱 등과 같은 다른 방법은 또한 PCR 생성물의 특이성 및 농도를 분석하는데 사용될 수있다. 2. 결과 해석 : 증폭 효율 : 증폭 효율의 품질은 PCR 제품의 밴드 다이어그램에 따라 판단 될 수 있습니다. 증폭 특이성 : 증폭 된 PCR 생성물은 단일 표적 서열만이 있어야하며, 특정 증폭에 지나지 않습니다. 성장 학위 : 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 제품의 길이가 기대에 부응하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 순도로의 순도 : PCR 생성물의 순도는 A260/A280의 비율을 결정함으로써 평가 될 수 있으며, PCR 생성물의 밀도를 DNA 크기 표준과 비교함으로써 농도를 추정 할 수있다.
PCR 시스템 구성의 4 가지 핵심 단계를 자세히 분석하고 구체화 한 후,이 과정의 모든 단계가 과학적 연구의 엄격함과 기술의 절묘함을 구현한다는 것을 찾는 것은 어렵지 않습니다. 템플릿 DNA의 정확한 추출, 반응 시스템의 신중한 제제, 사이클 파라미터의 정확한 조절, 최종 제품의 엄격한 식별에 이르기까지, PCR 시스템의 구성 단계는 정밀 장비와 같으며 서로 널리킹 하고이 강력한 생명 공학의 작동을 공동으로 주도합니다.
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