ELISA (효소-연결 면역 흡착제 분석)는 생물 의학 연구에서 일반적으로 사용되는 실험 방법이며 항체, 항원, 호르몬, 바이러스 등의 검출에 널리 사용된다. ELISA 테스트를 통해 연구원들은 정량적 또는 질적 분석 결과를 얻을 수있어 임상 진단, 질병 감시 및 약물 개발에서 대체 할 수 없습니다.
1. 코팅 단계 ELISA 감지의 첫 번째 단계는 코팅 된 플레이트에서 테스트 할 기본 구성 요소를 고정하는 것입니다. 이 과정은 주로 수동 흡착을 통해 달성되며, 그 효과는 코팅 물질의 특성에 달려 있습니다. 샘플이 다수의 항원을 함유하는 경우, 비특이적 결합을 피하기 위해 선택적 코팅 된 플레이트를 선택해야한다. 그러나, 간접 ELISA 방법에서 항체를 검출 할 때, 정제 된 항원이 사용되거나 샌드위치 ELISA 방법에서 캡처 항체를 사용 할 때, 코팅 된 플레이트는 이미 선택적이다. 코팅 된 보드의 재료는 대부분 폴리스티렌 또는 그 유도체이며, 결합 특성은 표적 물질 및 검출 요구 사항에 따라 다릅니다. 고도로 글리코 실화 단백질, 탄수화물 등과 같이 흡착하기 어려운 특정 물질의 경우 공유 결찰을 허용하는 특수 처리 코팅 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.
2. 인큐베이션 단계 시약을 코팅 플레이트에 첨가 한 후, 인큐베이션은 결합 또는 반응을 촉진해야합니다. 인큐베이션 온도와 시간은 검출 단계 및 작업에 따라 다릅니다. 전형적으로, 적용 후 샘플을 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 그러나, 차단과 같은 특정 단계는 냉장고에서 밤새 수행 될 수있다.
3. 세척 단계 세척은 ELISA 감지에서 중요한 단계입니다. 세척하는 동안, 포스페이트 완충 식염수 -20 (PBST)은 일반적으로 완충제로 사용하여 결합되지 않은 항원, 항체 또는 시약을 제거합니다. 다 채널 피펫 또는 자동 플레이트 세탁기를 사용하여 세척을 수동으로 수행 할 수 있습니다. 부적절한 세척은 배경 신호가 높을 수 있지만 과도한 세척은 샘플 신호를 낮출 수 있습니다. 세척의 일관성은 플레이트 결과의 신뢰성을 보장하기 위해 중요합니다.
iv. 차단 단계 단백질이 ELISA 플레이트로 코팅 한 후, 차단은 일반적으로 후속 단계에서 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 필요합니다. 차단 될 때, 검출과 관련이없는 혼합 단백질은 플레이트에 첨가되고 비특이적 결합 부위를 점유하도록 인큐베이션된다. 일반적으로 사용되는 차단 완충제에는 탈지 건조 우유, 소 혈청 알부민 (BSA) 및 카제인이 포함됩니다. 또한, Tween 20 또는 Triton X-100과 같은 비 이온 세제는 또한 차단제로 사용될 수 있지만, 차단 효과는 단백질만큼 오래 지속되지 않습니다. 비효율적 인 차단은 배경 노이즈를 증가시켜 감지 감도와 특이성을 줄일 수 있습니다.
5. 항체 단계 항체는 ELISA 검출의 주요 구성 요소이며, 올바른 항체를 선택하는 것이 중요합니다. 단일 클론 항체 및 폴리 클로 날 항체는 각각 장점과 단점을 사용하여 사용될 수있다. 모노클로 날 항체는 매우 특이 적이지만 폴리 클로 날 항체는 다수의 결합 지점에서 표적 물질에 결합하여 신호를 증폭시키고 민감성을 향상시킬 수있다. 2 차 항체의 사용은 단계와 검출 시간을 증가 시키지만 민감도가 증가 할 수 있습니다. 따라서 검출을 최적화 할 때는 적절한 항체 쌍을 찾아야합니다.
vi. 결정 단계 어떤 유형의 ELISA 테스트가 사용하든 마지막 단계는 측정입니다. 가장 일반적으로 사용되는 분석법은 가시 색상 변화의 효소-매개 화학 반응을 사용한 다음 UV-Vis 분광 광도계에 의한 측정을 사용하는 것입니다. 효소 결합 항원 또는 항체를 시험에 잘 첨가하고 그것이 존재하는 경우 표적 물질에 결합된다. 적절한 기질이 첨가 될 때, 효소는 표적 물질의 양에 비례하는 색 변화를 유발한다. 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)는 일반적으로 사용되는 컨쥬 게이트 중 하나이며 일반적으로 기질 3,3 ', 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)과 함께 사용됩니다. HRP의 작용하에, TMB는 파란색에서 노란색으로 바뀌었고, 황산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 마지막으로, 각 웰의 흡광도 값은 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450nm 대역에서 측정되었고, 예를 들어 블랭크 기공의 평균을 빼기, 기술적 반복의 평균 또는 표준 계산의 비율과 같은 검출 설계에 따라 보정 및 계산되었습니다.
ELISA 탐지는 다양한 의료 연구 및 진단에 널리 사용되는 복잡하지만 매우 중요한 실험 방법입니다. ELISA 테스트 과정을 이해하고 습득함으로써 과학 연구자들은 관련 데이터를 정확하고 신속하게 얻을 수있어 질병 및 약물 발달의 조기 진단을위한 과학적 기초를 제공 할 수 있습니다.
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