브래드 포드 방법

Bradford 방법은 비색 방법 (색 변화에 의존) 단백질 정량화 방법입니다. 이 방법의 핵심에는 Coomassie Bright Blue G-250 염료가 있습니다. 이 염료는 결합되지 않은 상태에서 붉은 갈색이며 465 nm의 파장에서 빛을 흡수합니다. 그러나, 그것이 주로 아르기닌 및 라이신 잔기를 통해 단백질에 결합 할 때, 염료의 색상은 청색으로 변하고 최대 흡광도는 595 nm가된다. 이러한 색상 및 흡광도의 변화는 단백질 농도에 비례하며 정량화에 사용될 수 있습니다.

브래드 포드 방법이 필요한 워크 플로

단백질 정제

각각의 정제 단계 후, 정제 단백질의 농도를 결정하는 것은 수율 및 순도를 평가하기 위해 필수적이다. Bradford 방법은 단백질을 정량화하기위한 빠르고 신뢰할 수있는 방법을 제공하여 연구자들이 어떤 구성 요소를 결합 해야하는지 결정하고 정제 과정의 효율성과 성공률을 평가하는 데 도움이됩니다.

세포 용 해물 준비

다운 스트림 응용 분야에 해적을 사용하기 전에 단백질 농도를 이해하는 것이 중요합니다. 이것은 동일한 양의 단백질이 다른 샘플에 사용되도록하여 일관되고 비슷한 결과를 초래합니다. 브래드 포드 방법은 일반적으로 이들 용 해물의 총 단백질 함량을 결정하는 데 사용됩니다.

SDS-PAGE 샘플 준비

정확한 결과를 얻으려면 SDS-PAGE 겔의 각 웰은 동일한 양의 단백질을 함유해야합니다. 이를 통해 각 차선의 스트립을 비교할 때 관찰 된 차이는 고르지 않은 하중이 아닌 실험 조건에 기인합니다. 브래드 포드 방법은 샘플의 단백질 농도를 조정하여 단백질 함량을 각 웰에서 동일하게 만드는 데 사용될 수 있습니다.

브래드 포드 탐지 방법

표준 곡선 방법

이것은 알려진 농도의 표준 단백질, 일반적으로 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 감마 글로불린을 사용하여 교정 곡선을 매핑하는 것을 포함하여 가장 일반적인 방법입니다.

1. 샘플에서 예상되는 단백질 농도의 범위를 덮기 위해 일련의 표준 단백질 희석을 준비하십시오.
2. 각 표준 희석에 브래드 포드 시약을 추가하고 짧은 시간 동안 (보통 5-10 분) 인큐베이션하십시오.
3. 각 표준의 흡광도는 분광 광도계를 사용하여 595 nm의 파장에서 측정되었다.
4. 흡광도 값을 알려진 단백질 농도와 비교하여 표준 곡선을 생성 하였다.
5. 알려지지 않은 샘플의 흡광도를 측정하고 표준 곡선에 기초하여 단백질 농도를 결정하십시오.

단일 포인트 방법

표준 곡선 방법에 대한 빠른 대안. 단일 알려진 농도의 표준 단백질을 사용하여 알려지지 않은 샘플에서 단백질 농도를 추정합니다.

1. 샘플의 예상 범위 내에서 농도를 갖는 단일 표준 단백질을 준비하십시오.
2. 표준 및 알 수없는 샘플에 Bradford 시약을 추가하십시오.
3. 표준 및 알려지지 않은 샘플의 흡광도를 측정하십시오.
4. 알려지지 않은 샘플의 단백질 농도는 알려진 표준 농도에 대한 흡광도의 비를 사용하여 계산된다.

마이크로 플레이트 방법

이 방법은 브래드 포드 방법을 개선하여 고 처리량 분석에 마이크로 플레이트를 사용하여 여러 샘플을 동시에 측정 할 수있게합니다.

1. 표준 샘플 및 미지의 샘플을 마이크로 플레이트의 웰로 전달하십시오.
2. 브래드 포드 시약을 각 우물에 추가하십시오.
3. 재배에 필요한 시간.
4. 각 웰의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 595 nm의 파장에서 측정되었다.
5. 표준 곡선 방법이 마이크로 플레이트 형식으로 사용되는 경우 표준의 흡광도 값은 알려진 농도와 비교하여 교정 곡선을 생성합니다. 이 곡선은 알려지지 않은 샘플의 단백질 농도를 결정하는 데 사용됩니다.

수동 피펫 팅과 비교하여 자동화 된 Bradford 방법의 장점 :

• 일관성과 반복성 : 자동화는 인간의 오류를 줄이고 결과를보다 일관성있게 만듭니다.
• 높은 처리량 : 자동화 된 시스템은 여러 샘플을 동시에 처리하여 효율성을 향상시킬 수 있습니다.
• 오염 위험 감소 : 자동화는 샘플 간 교차 오염 가능성을 최소화합니다.
• 데이터 로깅 : 자동화 시스템에는 일반적으로 데이터를 녹화하기 위해 소프트웨어가 장착되어 결과를보다 쉽게 ​​추적하고 분석 할 수 있습니다.