Dideoxy chain End Synthises Termination 방법으로도 알려진 Sanger 시퀀싱은 DNA 복제의 자연 과정을 기반으로합니다. 전기 영동 분리 후, 이들 조각은 특정 밴드 패턴을 형성한다.
1. 원리 Sanger 시퀀싱의 기본 원리는 DNA 폴리머 라제의 과정에 기초하여 DNA 주형에서 새로운 DNA 가닥을 합성합니다. 이 과정에서, 특수 설계된 이진 데 옥시 뉴클레오티드 트리 포스페이트 (DDNTP)를 첨가함으로써, DNA 폴리머 라제는 새로운 가닥 에서이 특수 뉴클레오티드를 만날 때 합성을 중지한다. DDNTP는 5 '및 3'위치에서 하이드 록실기를 함유하지 않기 때문에, 다음 뉴클레오티드와의 포스 포 디스터 결합을 형성 할 수 없어서 DNA 가닥의 연장을 종료시킨다. 이들 정지의 위치를 결정함으로써, DNA 서열을 결정할 수있다.
2. 단계 1. DNA 주형 준비 : 서열의 DNA를 단일 가닥으로 측정 할 수있는 서열의 DNA를 분리하고, 단일 가닥의 3 '끝에 알려진 서열의 작은 프라이머 조각을 추가하여 단일 가닥 DNA에 연결한다. 2. 반응 시스템 설정 : DNA 폴리머 라제, 4 개의 데 옥시 뉴클레오티드 (DNTP : DATP : DATP, DGTP, DCTP, DTTP) 및 낮은 농도의 DDNTP를 반응 시스템에 추가합니다. DDNTP는 체인 터미네이터로서 작용하고, 각각의 DDNTP는 각각 A, G, C 및 T의 종료에 해당한다. 3. 문자열 확장 및 종료 : 프라이머의 안내하에 DNA 폴리머 라제는 가닥을 연장하기 위해 염기 쌍에 DNTP를 추가합니다. DDNTP가 발생하면, 가닥 연장이 중지되어 상이한 길이의 일련의 DNA 단편을 형성한다. 4. 전기 영동 분리 : 반응 생성물은 전기 영동에 의해 분리되고, 상이한 길이의 DNA 단편이 크기 순서대로 배열된다. 5. 형광 검출 : 전기 영동에 의해 분리 된 DNA 단편은 자동 시퀀서에 배치되고, 기기는 DNA 단편의 길이에 따라 각 DDNTP에 의해 생성 된 형광 신호를 기록한다. 6. 서열 재구성 : 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 형광 신호의 피크 및 서열에 따라 원래 DNA 서열을 재구성합니다.
3. 장거리 읽기 길이 : Sanger 시퀀싱의 읽기 길이는 일반적으로 800 ~ 1000bp 사이이며 한 번에 더 긴 DNA 서열을 읽을 수 있습니다. 2. 높은 정확도 : Sanger 시퀀싱은 DNA 폴리머 라제의 합성 과정을 기반으로하기 때문에 높은 기본 판독 정확도를 갖습니다. 3. 직관적 인 결과 : 시퀀싱 결과는 직관적이고 이해하기 쉬운 전기 영동 맵 및 형광 신호를 통해 직접 해석 할 수 있습니다.
4. Sanger 시퀀싱의 적용은 인간 게놈 프로젝트에서 중요한 역할을했으며 여전히 매우 정확하고 신뢰할 수있는 시퀀싱 데이터를 얻는 데 널리 사용됩니다. 그 적용 분야는 다음과 같은 이에 국한되지 않습니다. 1. 유전자 연구 : 유전자의 정확한 서열을 결정하고 유전자의 구조와 기능을 연구하는 데 사용됩니다. 2. 질병 진단 : 특정 유전자의 서열을 시퀀싱함으로써 특정 유전성 질환이 진단 될 수 있습니다. 3. 약물 개발 : 약물 표적의 서열 정보를 이해하면 약물의 설계 및 개발에 도움이 될 것입니다. 4. 법의학 : DNA 지문 분석, 친자 관계 테스트 및 기타 분야에서 광범위한 응용 프로그램이 있습니다.
5. 제한 Sanger 시퀀싱에는 많은 장점이 있지만 몇 가지 한계가 있습니다. 1. 낮은 처리량 : 한 번에 하나 또는 소량의 DNA 단편 만 시퀀싱 될 수 있으며, 이는 대규모 시퀀싱 프로젝트에 덜 효율적입니다. 2. 시간 소모 : 시퀀싱 프로세스는 DNA 추출, 라이브러리 구성, 시퀀싱 및 데이터 분석과 같은 단계를 포함하여 오랜 시간이 걸립니다. 3. 높은 비용 : 시퀀싱 공정의 복잡성과 필요한 시약으로 인해 Sanger 시퀀싱 비용이 상대적으로 높습니다.
고전적인 DNA 시퀀싱 방법으로서 Sanger 시퀀싱은 유전자 연구, 질병 진단, 약물 개발 및 법의학 분야에서 널리 사용되어왔다. 그러나, 고 처리량 시퀀싱 기술의 개발로 인해 Sanger 시퀀싱은 일부 측면에서 점차 대체되었습니다.
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