自动微生物组提取:无偏差,高通量,质量结果

作者
林乔纳森1瑞恩萨萨达1,杰萨里雷德2,霍马姆贾马尔2,金纳里沃森21Zymo研究2Optrens实验室公司。

摘要
微生物学是一个具有重要意义的新兴领域为人类健康的广泛的主题。现代的测序技术可以提供丰富和新颖的数据但受到DNA提取方法的限制,这困难、耗时,特别是在微生物方面样本,容易产生偏差。自动化系统可以解决其中一些挑战,但必须小心设计和校准,并需要配合适当的试剂来提供高质量的结果。
在目前的一套测试中,视中心子采用OT-2核酸提取工作站ZymoBIOMICSTM 96磁珠DNA试剂盒从典型的微生物样本中提取DNA。表演对该系统和试剂盒的产量和纯度指标进行了评估。提取偏倚和交叉污染分别是也评估。结果表明,OT-2结合在一起使用ZymoBIOMICS试剂盒生产了高产、高纯度的DNA样品,没有偏倚和交叉污染。确定了若干项调整以进一步改进表演总之,这些测试例证了OT-2在不同应用程序实现过程中的准确性和精度,提供了最佳的性能行业领先的微生物学DNA提取试剂盒。

介绍
人类的微生物群已不再处于生物学研究的背景。多样,大,和微生物群非常活跃,已经成为人们关注的焦点,它因其在人类健康方面的广泛作用而日益受到重视,包括传染病、昼夜节律和心理状况的作用。自动化可以支持这一新兴领域在关键的核酸提取步骤中具有无偏置性能的领域。
优质的DNA提取依赖于有效的溶解,即特别是对微生物组样本的挑战性它们所含的各种生物体。一些生物更耐寒,更耐溶解,而其他的更容易溶解,更容易溶解。如果一种裂解法不能克服这些差异,耐寒的物种将会产生更少的DNA,而更易感的物种会产生更多,导致下游分析中有偏倚代表性。

通常使用两种主要裂解法:酶法或基于试剂的裂解和机械裂解。这个在ZymoBIOMICS 96磁珠DNA试剂盒中使用基于珠技术的机械裂解试剂盒使用超高密度,混蛋珠tm来传递微生物的均匀溶解并与自动化,因为珠子是预装在准备样品的管。

自动化为DNA提供了进一步的改进提取除了裂解的挑战,手工DNA提取协议是耗时且容易产生的由错误和差异引起的可变性实验室技术人员的性能。自动化程序可以消除可变性和增加吞吐量,但必须小心校准,以确保DNA被分离出来产量和纯度都很好。

本研究试图评估OT-2核酸提取自动工作站与ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA的性能微生物学试剂盒。测定了收率和纯度在典型的微生物学粪便样本中使用标准提取性能指标。这些指标是比较了自动工作站和由训练有素的手工程序技术人员对自动化工作站也进行了测试用于板井间的交叉污染。

该测试旨在优化该试剂盒和系统的方案。
OT-2避免了提取偏倚,并交付的样品的产率和纯度与由训练有素的技术人员执行的手工程序相当。横井污染程度在两者之间也具有可比性。两种提取方法。此外,一些协议使用OT-2自动化工作流程进行了调整,以提高产量和减少周转时间。

结果
使用OT-2工作站和ZymoBIOMICS MagBead试剂盒自动提取DNA,成功地纯化了DNA,没有引入偏倚纯化偏倚可能是由于不均匀的裂解之间造成的一个样本中的微生物群物种。有些物种较少易于溶解,因此可能被代表不足在下游测序数据中。混蛋珠ZymoBIOMICS试剂盒中使用的技术是一种通过珠磨机或珠磨机进行机械分解的系统跳动的技术。这种技术包括将样品与小玻璃、钢或陶瓷珠结合起来用力混合两者。1在混合过程中,珠子与细胞发生碰撞,打破细胞膜和细胞壁,释放DNA。打珠试剂使用超高密度珠子可以以这种方式均匀地溶解微生物样品,防止偏倚。

为了评估这种性能,我们使用OT-2工作站和ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA提取DNA试剂盒对酶ZymoBIOMICS的样品进行了检测微生物群落标准(N=8)。提取的DNA用16S rRNA基因靶向测序进行分析,引物针对V3-V4区域伊利诺斯州的测序®MiSeq™仪器。微生物群落标准是一个明确的特征参考样品的种类包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及酵母菌不同的大小和细胞壁组成。由偏置裂解法产生的观察到的组成不能反映标准品的理论组成。测序数据显示,使用OT-2核酸提取工作站和ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA试剂盒进行自动提取,并观察到高保真度符合微生物群落标准的微生物图谱(图1)。

自动提取没有引入纯化
图1:自动提取没有引入纯化
偏差观察提取的DNA组成与ZymoBIOMICS微生物群落标准的理论组成显示在已测序物种的相对丰度上物种级使用针对V3-V4区域的引物,对社区标准样本进行16S rRNA靶向测序,然后在Illumina MiSeq测序仪上进行测序。观察到的提取样品的组成与已知标准品的理论组成非常吻合。

试剂盒自动化提供了收率和纯度匹配的手动提取OT-2核酸提取物的性能工作站与酶微生物学96 MagBead从典型微生物粪便样本中提取DNA的DNA试剂盒进行DNA产量和纯度评估,并与经过高度训练有素的技术人员执行的手工程序进行比较(N=12)。采用纳米Drop2000紫外-可见分光光度计进行测量DNA浓度和吸光度比(A260/230、A260/280)。

手动和自动化的程序交付在附近相同的结果(图2)。自动化和手动操作该程序的平均产率为57.88ng/µLand 57.85ng/µL,平均吸光度值为260/2801.94和1.90,平均吸光度值为260/230分别为1.85和1.87。自动化程序避免了交叉污染板井之间的交叉污染存在aDNA提取程序的重大问题,因为被污染的样本会损害数据的完整性。然而,污染可能很难预防手工处理程序相比之下,自动化可以减少污染,促进审计程序如果污染确实发生了,它将会被识别出来。向评估OT-2核酸提取工作站对于交叉污染,新型隐球菌和将酶微生物学DNase/Fre-rnase水加入a96孔板,交替使用,棋盘式使用。平板用自动工作站进行处理,每个孔的洗脱液用Femto进行qPCR检测tmCFX96上的细菌DNA定量试剂盒。

触摸实时PCR检测系统在任何充满水的对照井中检测到新生儿,这表明没有发生交叉污染(图3)。

触摸实时PCR检测系统

图2:自动化和人工程序提供了相当的DNA产量和纯度。用OT-2核酸提取工作站和ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA试剂盒从粪便样本中提取DNA。用ng/µL法测定纯化后的DNA的产量和纯度,和260/280和使用NanoDrop 2000紫外-可见分光光度法获得的260/230的吸光度值,在收率(A)和纯度(B和C)方面得到了几乎相同的结果。

自动化并没有引入井间的交叉污染
图3:自动化并没有引入井间的交叉污染。C. 在使用OT-2核酸提取工作站和Femto细菌DNA定量试剂盒检测系统之前,对新生和DNAse/rNAse游离水进行qPCR分析。C.在充满水的对照孔中,>38的Ct值(灰色细胞)显示,未检测到新生细胞。 C.在样品孔中检测到新生菌,其Ct值大约介于10.5和12个(蓝色单元格)。

结论
对DNA提取方法的评价OT-2核酸提取工作站与之配套ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA试剂盒显示没有净化偏差。自动提取提供的产率和纯度与训练有素的技术人员的手工提取相当,同时避免了井间的交叉污染。此外,还发现了一些协议调整,以提高提取工作流程的性能和速度。

采用OT-2核酸提取工作站和ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA试剂盒提取DNA,获得高纯度DNA,收率高净化偏倚或交叉污染。优秀

没有污染或纯化偏差的性能是必要的DNA提取协议保持。随着微生物学研究的不断发展。这些高性能的结果表明,OT-2可以为微生物的工作流程提供一个可靠的纯化解决方案。这些数据还展示了OT-2对支持广泛应用程序的工具包的使用的灵活性。OT-2可以提供增加的吞吐量和减少的周转时间,以促进更雄心勃勃的实验,节省宝贵的时间,同时保持高质量数据的高标准。

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