如何提高移液数据的重现性?

1 引言
鉴于对数据可靠性的顾虑,以及无法重现已发布的研究结果,生命科学正陷于“重现性危机”之中。大多数科研人员报告称未能重现实验(包括其本人的实验),因此需要采取更多步骤来改善已发布的研究结果的可靠性与可信度。但是,有哪些因素导致了这种科学“危机”,应如何实施简单的移液解决方案来应对这一危机?本白皮书概述了重现性危机的严重程度,探讨了造成实验无法重现的五个主要因素,并讨论了良好的移液器选择和技术如何避免因液体处理不准确而导致可重现性差的问题。

影响移液数据的因素图

2 数据重现性危机
重现性不仅仅是特定时间、地点或人物的人为现象,它还是科学方法的基石,是确认所观察到的结果是否符合假设的必要条件。科学界依靠同行评审出版流程来确保科研成果准确无误,这意味着从表面上看,大多数科研成果一经发布便很少受到质疑。因此,很少有人会重复这些研究,已发布研究结果即被视为事实,而研究领域则可能建立在一个不可重现的研究结果之上。我们目前注重减少在科学研究中使用动物进行实验(比如“3 R”框架,通过动物替代、动物减少和研究改进来进行更人道的动物研究),而这进一步加剧了这一现象。这一框架建议优先考虑“真正进入知识库”的研究,但这却无法促进现有知识的重现。然而,如果特定研究结果无法在不同环境下由不同人员重现,则我们不能这一结果视为真正的科学现象,只能将其视为特定实验条件下的产物。

John Ioannidis于2005年发表了题为“为何大多数已发表的研究结果都是错误的”(1) 的期刊文章,此文颇具争议,(生物)医学领域的可重现性危机由此成为人们关注的焦点。模拟与建模结果表明,对于大多数研究设计而言,已发布研究结果很可能是错误的,它们只是当前普遍偏差下的准确测量结果。

近二十年前就有人提出了数据重现性问题,如今这一问题仍然普遍存在。近期,《自然》的一项调查结果显示,70%以上的科研人员报告称未能重现已发表的实验结果 (2)。而令人担忧的是,50%以上的科研人员报告称未能重现自己的实验。现在大家一致认为,这一问题非常严重,已经导致生物学领域和医学领域深陷重现性危机。大多数研究人员表示,尽管自己认同这一观点,但还是相信已发表的文献。

重现性危机不仅扰乱了基础科学的知识库,还严重影响了工业应用的开发计划。显然,我们需要利用解决方案来提高数据可靠性和解决科学领域的重现性危机,但有哪些因素会导致缺乏可重现性?

3 影响数据重现性的因素
想要应对重现性危机,首先要承认科学界存在数据重现性问题,然后应该考虑和了解影响数据可靠性的主要因素,再在整个实验过程中(从初始规划到实验程序和最终分析)采取步骤来避免这些因素。

3.1 文化
可以说,没有察觉到研究不可重现的主要原因在于,当前科学文化不鼓励发表负面研究结果。科研人员无法重现某一实验通常是因为没有正确进行实验、缺乏必要技能,或是因为可用方法方案的细节不足以支持重现该实验。然而,即使在众多实验室成员在尝试多次仍然失败后认为该实验不可重现,各杂志也可能不愿意发表负面研究结果。即使发表了,负面研究结果也通常会被视为具有争议且会被反驳。正如《自然》的调查结果中所述,“数位曾公开发表实验重现失败结果的受访者表示,编辑和审稿人要求将这些研究和初始研究进行比较。”但知名期刊认识到了这个问题,因而发表负面研究结果比以往更容易,其中包括杂志PLOS One杂志的特刊“The Missing Pieces:负面结果、无结果和无法得出结论的研究结果”文章合集 (3)。

3.2 强调P值
研究中不可重现率较高很可能是因为研究人员根据在单项研究中观察到的统计显著性(通常P值小于0.05)声称得出结论性结果。显著性P < 0.05这一黄金标准也可能会导致研究人员错误地解读错误的结果,这一标准不一定能够确认研究结果具有实践意义和重要意义,也无法表明在其他地方进行同一实验时数据是否仍然具有显著性。依靠是否达到统计显著性来认定某项研究是否值得发表,导致了科研人员采取“p值操纵”的做法 (4)。这种恶意行为可能包括设计和进行实验,通过数据疏浚、数据捕鱼、数据挖掘或数据捕获来确保结果具有显著性或利用数据分析。

3.3 缺乏透明度和原始数据
仅在最近几年,才开始鼓励向研究人员提供对研究背后原始数据的完全访问权限。然而,在生物医学领域,因为研究成果可以通过商业化产生巨大财富,数据收集和分析的具体方式仍然缺乏透明度。老实说,期刊文章有字数限制,因此在很多情况下难以包含成功重现复杂实验所需的所有方法细节。而在其他需要考虑商业前景或知识产权前景的领域,原稿中可能会删除或混淆专有信息。如果原始数据本身提供了有价值的产物(例如影响药物研发的基因组数据库),则这些数据通常会出于商业原因处于保密状态。因此,外部研究人员无法独立验证已发布的研究结果,从而无法确定该结果是否具有可重现性和结论性。

3.4 实验室规范和记录保存不当
从较为基本的层面来讲,实验不可重现可能是因为初始实验科研人员和重复实验科研人员的实验室技术不佳,他们应该尽可能采用标准方式来施用技术,以便其他科研人员也可以使用这些技术。如果针对某一特定方案(可能无法通过文本方案来理解)开发了新技术,则可以随附视频教程。细小步骤可能会被忽略,没有包含在已发布的方法方案中,因此,记录不详细也会影响可重现性。

3.5 非标准设备的质量各异
多种可用的实验室设备和仪器也会影响方案的标准化。不同品牌仪器的整体功能也许相似,但其精度可能各有不同。不同品牌之间灵敏度、特异度、检测水平等方面的差异可能会对实验结果产生显著影响。因此,需要提供详细的材料和设备清单以及已发布的方案,明确说明所用物品的品牌、型号、批号等信息。应尽可能使用优质设备和材料,以减少可能与更廉价材料相关的差异。设备未经校准以及在科研人员不知情的情况下更改实验参数都可能会进一步加剧这些问题。

4 通过易于实施的移液解决方案提高重现性
重现性危机是一大系统性问题,科学方法的许多阶段都需要考虑这一问题并采取解决方案,但可以从改进简单过程开始来提高数据可靠性。改进涉及多个科学工作流程阶段的过程可以提高数据可靠性,从而获得高回报。

我们的使命是创建可靠且易于验证的高精度仪器,以帮助研究人员实现可重现的科学。手动移液是一种容易忽略的生命科学工具,这种工具要求准确度要精确到微升级,可以说在所有过程中都使用得比较多,因此是提高可重现性的关键过程。幸运的是,移液解决方案操作简单且经济实惠,对整个工作台工作流程中都有着积极影响。

4.1 选择优质移液器
如要实现可重现移液,要先选择在整个移液循环(吸液和分液)中都准确无误的优质移液器。移液器的真实值(亦称作准确度)是指吸取和分配接近容量设置所示的真实值或标称值溶液容量的能力。移液器的精度是指在多次重复操作中分配相同容量溶液的能力。因此,可以通过平衡高真实值和/或高精度来实现移液器的整体移液性能,从而分别实现低系统误差和/或低随机误差。

选择优质移液器后,仍有多种因素会对准确度
产生负面影响:

  • 用户技术
  • 环境因素(包括温度、湿度和压力)
  • 液体样品特性(即高粘度)
  • 仪器误差
    尽管这些因素难以控制,但使用高端仪器对于提高移液器的性能而言是简单易行的解决方案。

所选移液器应采用先进的制造工艺,以达到能够保持长期准确(真实值和精度)的允差。购买新的移液器时,应比较供应商之间所述的系统误差规格和随机误差规格。
为说明不同品牌之间的差异,表1比较了2 µL、20 µL、200 µL和1000 µL 标称值范围内高端移液器和低端移液器之间的技术规格。总体而言,高端仪器的随机误差性能更佳。此外,应特别注意低容量移液器 — 即分液容量小于10 µL的移液器,因为移液技术和样品粘度对低容量分液的负面影响较大,会导致准确度降低和预期容量减小。因此,用户应选择出厂时仪器误差较小的移液器。

移液器的技术规格比较


对于精度和重复性要求较高的分子工作流程(如逆转录-聚合酶链反应,RT-PCR)来说,劣质仪器相对较低的精度会对实验的可重现性产生显著影响。

4.2 确保正确实施日常维护、校准与性能验证
移液器是实验室中广泛使用的设备,经常遭受磨损。移液器由多种机械零件构成,这些零件彼此可以移动,经常会接触到腐蚀性化学物质或有害化学物质。和所有其他机械性产品一样,移液器零件会随着时间的推移而劣化,进而严重影响移液器性能。高端的移液器和仪器可以保证比低价的替代品更经久耐用,但它们仍然需要定期维护、验证和校准,以确保在实验中保持始终如一的性能和可重现性。

移液器维护
移液器维护包括日常保养和预防性维护。妥善保养移液器可以尽量提高维修间隔期间的性能、防止移液器因损坏而无法使用。可以进行简单的日常活动,以确保移液器正常工作。

定期检查移液器是否存在任何可见的损坏迹象,例如移液器外壳有划痕或破损。这一活动可以指示移液器是否掉落,移液器掉落可能会导致损坏,并且需要维修或校准。

定期清洁移液器,以防灰尘或污垢进入工作件,进而导致工作件摩擦或卡住。使用制造商推荐的无磨蚀性清洁溶液清洁移液器,然后使用无绒布擦拭移液器。

正确消毒移液器(将暴露在紫外光下的时间限制在10-15分钟),以免移液器外壳的完整性受损。持续高压灭菌导致移液器经常暴露在高温、高压和高湿度条件下,这也可能会影响其性能,因此应在每次高压灭菌后进行性能验证。

安全存放移液器,将其置于合适的盒装或平台装置中,以防掉落和损坏。

切勿倒置移液器(液体处理期间),以免液体进入仪器。滤芯吸头有助于防止液体和污染物进入移液器。

日常保养移液器有助于在维修间隔期间维持移液器性能,但预防性维护对于防止移液器突然故障仍然至关重要。Rainin服务数据显示,如果没有进行任何预防性维护或执行定期维修程序,那么即使每年都进行检查,移液器的故障率仍会达20%或以上。大约95%的移液器故障都是因为密封系统缺陷,这种故障可以预测,也可以预防。预防性维护旨在更换磨损的组件(比如O形圈、密封件和柱塞),以免其发生故障并进一步损坏周围部件。

根据制造商的建议和我们的丰富经验,在正常使用条件下,密封件应每年至少更换一次,而吸头支架和活塞应每三到五年更换一次。预防性维护有助于确保维持移液器性能、防止移液器故障和保持实验合规和可重现,进而避免工作流程中断。

校准
建议每年至少进行一次预防性维护,以确保移液器功能操作正常,但需要增加移液器的校准频率,以确保其准确度保持在(亚)微升级。真实的吸液量和分液量无从知晓,因此移液器校准不当会显著降低实验的可重现性,进而导致已发布的实验方案不准确。

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