在OT-2上使用Thermo Fisher Dynabeads 进行免疫沉淀

作者

Boren  Lin,PhD1,Kinnari  Watson,PhDl 1Opentrons  Labworks,Inc.

摘要
本次研究在Opentrons OT-2自动化移液工作站上进行了自 动化的磁珠法免疫沉淀测试,实验流程可处理多达96个样 品,并最大限度地减少人工操作时间。我们用裂解缓冲液 稀释重组 GAPDH 蛋白或者直接使用 HEp-2 细胞裂解产物 进行样本制备,并偶联蛋白G 或者蛋白A, 然后在 Thermo Fisher Dynabeads 上进行免疫沉淀实验(蛋白G和蛋白A 可与可溶性抗体结合,进而促进随后与目标蛋白 GAPDH 的 结合)。蛋白质分析结果显示,目标蛋白质成功地从样品溶 液中提取出来,并符合预期效果的一致性,证明了 OT-2 具备自动化进行免疫沉淀实验的能力。

简介
免疫沉淀是一种常见的实验方法,利用抗体在分子混合物 中捕获目标蛋白质。抗体可以预先连接到固相基质(如琼 脂糖树脂或磁珠)上,然后与目标蛋白质接触,或者直接 与样品一起加入相应的固相基质。由于孵育时间取决于抗 体与目标蛋白质的亲和力,不同的目标捕获蛋白所需的孵 育时间也会不一样。使用磁珠提取,抗体-蛋白质-磁珠复合物会通过离心或磁力的方式进行沉淀收集。

DynabeadsM(Thermo Fisher Scientific,USA) 是一款可 以根据需求调整以获得不同功能的超顺磁珠。例如,重组的 蛋白G或蛋白A可以共价地结合到磁珠表面。蛋白G和蛋白A 都是细菌蛋白,对单克隆或多克隆 IgG 型抗体的 Fc 区域表现 出高亲和力。DynabeadsTM- 蛋白G 或 DynabeadsTM- 蛋白 A可作为抗体的固相支持材料。Opentrons 以 DynabeadsM为基础设计了高效自动化的实验程序进行免疫沉淀实验,每次实验可处理最多96个样品,样品之间具有良好的重复性。

材料和方法
实验步骤包括以下内容:
第一部分是磁珠、抗体和样品的混合制备;由用户确定的抗体/目标蛋白的孵育时间;
第二部分是洗涤和洗脱步骤(图1)。
第一部分和第二部分在 OT-2 上进行,使用磁珠纯化模块将磁 珠从溶液中分离出来,并使用温控模块制备变性蛋白的洗脱液进行 SDS-PAGE。 孵育过程在热振荡仪(选配)上进行。
免疫沉淀实验的第一部分和第二部分的 OT-2 装载布局如图2 所示。这个流程旨在将试剂直接从15 mL 离心管转移到工作板上进行磁珠分离。
另外,在 OT-2 上使用自动化程序预填充试剂板,可以减少实 验时间。抗体与目标蛋白的结合是免疫沉淀成功的最关键步 骤,这取决于抗体的亲和力。对于结合亲和力低或丰度较低的抗体,建议在样品溶液中进行预孵育。

蛋白纯化的三个主要步骤的概述
磁珠纯化模块
磁珠纯化模块
耗材和模块甲板摆放示意图
试管试剂示意图
图4:试管里的试剂和孔板里的试剂所需的运行时间和盒装吸头数量。

结果
兔子IgG 对 蛋 白G 和蛋白A 都具有高亲和性,为了确认抗体与 DynabeadsM 的相互作用,我们使用了抗 GAPDH 的免多克隆 gG 抗体(ProteintechRosemont,IL,USA) 。 在 OT-2 上,将 50μL 的磁珠悬液与含有2.5μg GAPDH 抗体的200μL PBS 混 合,然后室温下于振荡器上800 rpm 混匀10分钟。随后,在 OT-2上用0 . 1% Tween 20 的磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS-T) 洗涤3次。70°℃加热10分钟、使用Laemmli 样品缓冲液 (Bio-Rad,USA) 洗脱结合的 GAPDH 抗体。然后,对其进 行SDS-PAGE 分离,再用近红外发光染料 (IRDye 680RD)偶 联的山羊抗兔 IgG 抗体 (LI-COR Biosciences,USA)进行探针探测。Western Blot 分析结果显示,当进行四次重复操作时,无论是蛋白G 还是蛋白A 磁珠都能够与 GAPDH 抗体结合(图5A), 且结合具备可重复性。
为了进行 GAPDH 的免疫沉淀,我们在 OT-2 上使用含有重组 人 GAPDH 蛋 白(rhGAPDH,Thermo Fisher Scientific, USA) 的样品进行免疫沉淀处理。同时使用结合了 GAPDH 抗 体的 DynabeadsTM-蛋白G和蛋白A的 GAPDH抗体进行测试。 Western Blot结果显示出GAPDH 的存在,验证了OT-2 具备运行自动化免疫沉淀的能力(图5B)。
该方法还针对培养细胞中内源性 GAPDH 进行了自动化免疫沉淀评估。HEp-2 细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的 GibcoTM最低基础培养基(Thermo Fisher Scientific,USA) 中培养,在5% CO2 和37°℃条件下进行。为了准备测试的细胞裂解液,收集了4 x106 个 HEp-2 细胞,并在200μLPierceTM IP 的裂解缓冲液中进行裂解,该缓冲液中还加入了Thermo Fisher Scientific 提供的蛋白酶抑制剂混合物。使用DynabeadsTM- 蛋白A在 OT-2 平台上进行免疫沉淀实验,OT-2移液平台搭载了磁珠纯化模块和温控模块。为了让抗体与目标蛋白结合有足够的时间,将混合物放置于4°℃热振荡仪上,在800 rpm的转速下孵育过夜。最后通过Western Blot 定量,结果进一步证明了本次免疫沉淀实验成功具有良好的重复性(图6)。本次实验处理了96个样本,免疫沉淀的细胞裂解液加载在96孔样品板的最后一列,而样品板的其余位置只装载了裂解缓冲液。

结论
OT-2 在中高通量工作流程中利用 Dynabeads 进行自动化免疫沉淀具备较好的能力和实用性。我们开发的应用协议能够替代手动程序,并减少了操作时间,同时提供了优秀的重复性。

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