使用 Opentrons 蛋白质纯化工作站进行基于 Ni-NTA 磁珠的蛋白质纯化

作者

Boren   Lin,PhD',Kinnari   Watson,PhD 1Opentrons  Labworks,Inc.

摘要
本次测试研究的是在 Opentrons OT-2 自动化移液工作站上进 行基于磁珠的固定化金属亲和层析法 (IMAC) 。 我们使用 PierceTM Ni-NTA 磁性琼脂糖珠 (Thermo Fisher Scientific, USA) 测试了该方案,用于在OT-2 上提取目标蛋白(带有 His 标签的 GAPDH), 使用裂解缓冲液稀释的重组 GAPDH 蛋白、HEp-2 细胞裂解液和菌细胞制备的样品。

关键发现
在Opentrons 蛋白质纯化工作站上可使用 Ni-NTA 磁珠进行重组 GAPDH 蛋白纯化。
■ 实验结果证明所得蛋白为目标蛋白,具有良好的一致性和 特异性。
■ i该方案可以处理多达96个样品,并最大限度地减少需要手动操作的时间。

简介
蛋白质纯化的目的是为了获得高纯度的稳定活性蛋白质,以供下游分析、研究或治疗使用。固定化金属亲和层析法 (IMAC)利用金属离子提取具有基因工程标签的重组蛋白,能够螯合金 属离子的肽链。镍-三乙醇胺四乙酸 (Ni-NTA) 与琼脂糖树脂 或磁珠结合是常用的 IMAC 工具,用于纯化多组氨酸 (His) 标 记的蛋白质。由于His残基可以整合镍离子(Ni?+),His 标记的蛋白对固定了 Ni2* 的载体表现出很强的亲和力。在 Opentrons 蛋白质纯化工作站上使用 Pierce Ni-NTA 琼脂糖磁珠提取带有 His标签的GAPDH。

材料和方法
IMAC Protocol 实验流程概述
IMAC protocol 的流程分为几个部分:
第一部分:样品/磁珠混合物的制备。目标捕获部分不在OT-2平台上进行。
第二部分:洗涤和洗脱。具体流程如图1所示。
第一部分和第二部分都在OT-2 上执行。针对96个样品,第一 部分运行时间为57分钟,随后在摇床上进行30分钟的目标捕获。第二部分需要78分钟完成。

OT-2 平台上的 Ni-NTA 实验流程
第一部分和第二部分的设备布局图如下(见图2)。协议的第 一部分和第二部分均在 OT-2 平台上进行,并使用磁珠纯化模 块将磁珠从溶液中分离出来。样品处理过程中,将500 μL 人 源 His标记的 GAPDH 溶液与12.5 μL 沉淀的磁珠混合,并在 室温下以800 rpm 的速度孵育30分钟。经过2 个洗涤步骤 后,目标蛋白在250 μL 洗脱缓冲液中以800 rpm 和室温的条 件在摇床上洗脱10分钟。取20 μL 洗脱物进行 SDS-PAGE 和 Western Blot 分析,使用单克隆抗-GAPDH 抗体 (Thermo Fisher Scientific,USA)和与荧光染料偶联的二抗 (LI-COR Biosciences,USA) 进行检测。

蛋白质纯化工作站上基于 Ni-NTA 磁珠的蛋白质纯化工作流程概述
蛋白质纯化工作站上运行 Ni-NTA  应用协议的甲板布局图

结果
GAPDH 在重复实验中提取得到 一 致的样品处理结果(通过Western blot 分析的蛋白带信号测定, CV=6%) ( 图3)。部分提取物通过使用 QubitTM 蛋 白 质 分 析 (ThermoFisher Scientific,USA) 进行定量,证明了高蛋白质产量( 图 4A) 。 此 外 , 使 用Opentrons 蛋白质纯化工作站进行 的蛋白质纯化过程不会破坏蛋白质的酶活性,这是通过GAPDH 活 性 分 析 (Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)检 测 得 出 的 ( 图 4B)。

His 标记的GAPDH提取结果符合预期

Ni-NTA 介导的敲低实验对于在细胞或组织样本中分离 外源表达的 His 标记蛋白质非常有用。上一个方案用于纯 化 2 0 0 μLHEp-2 细胞裂解液中的 His 标 记 GAPDH。
结果再次证明 His-GAPDH 成功被提取,并且与非标记 蛋白的结合相比,Ni-NTA 磁珠的亲和力特异性非常高 (图5)。在大规模蛋白质生产中,常用大肠杆菌进行重组蛋白表达。通过裂解带有或不带 IPTG 诱导的 His标记 GAPDH 表达的细菌细胞来制备细胞裂解液。结果进一步确认了该方案成功地使用 Ni-NTA 磁珠进行了带有 His 标 记 的 蛋 白 质 纯 化 ( 图 6 ) 。
在这项研究中处理了96个样本,显示的结果仅为在96 孔样品板的最后 一 列中的8个样品。同时,实验结果也对不同样本规模的运行时间进行了评估(图7)。

实验产出的蛋白质产量高

结论
本次研究在 Opentrons 蛋白质纯化工作站上运行了一种基于磁珠的 His 标记重组 GAPDH 蛋白质纯化的自动化实验流程解 决方案。实验证明, Opentrons 蛋白质纯化工作站可以在中到高通量的设置中稳定高效地处理样本,减少操作时间,同时提供符合预期的可重复性的产出。

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