在OT-2上使用Biotage双流色谱PhyTip柱进行自动化蛋白质纯化

作者:

Boren    Lin,PhD,Shadie     Nimri?Sean    Arabian?Kinnari     Watson,PhDI 1Opentrons   Labworks,Inc.,?Biotage   LLC.

摘要
本次应用针对使用 BiotagePhyTip° 柱在 Opentrons OT-2 自动 化移液工作站上进行双流层析的自动化进行了应用开发。测试了两 种类型的 PhyTip 柱:用于 His 标记蛋白提取的 Ni-IMAC 柱和用于 人源 IgG 纯化的蛋白 A 系列柱,包括蛋白 A、ProPlus 和ProPlus LX。结果表明,OT-2 和 PhyTip 柱结合使用96孔板进行小规模蛋白样品处理,可获得优异的样品产量、浓度。

关键发现
在使用PhyTip Ni-IMAC柱进行纯化时, OT-2 能够在保持活性 的同时对His标记的GAPDH 蛋白进行纯化。同时,在使用蛋白 A、ProPlus 和 ProPlus LX PhyTip 柱进行人源 IgG 纯化时,OT-2 也展现了出色的纯化能力。使用蛋白A、ProPlus 和ProPlus LX PhyTip 柱,可以在OT-2上全自动运行多步骤纯化,例如免疫沉淀。
● 蛋白质分析验证了提取蛋白为目标蛋白,成品是符合预期的。
● 在实验设置中,该应用协议可以处理最多96个样品,且仅需占用很少的人工操作时间。

简介
近年来,由于蛋白质表征分析和功能测定的发展迅速,行业对蛋白 质分析的需求与日俱增。因此,许多可用于通过亲和层析扩大蛋白 质分离通量的技术应运而生,而亲和层析已成为早期药物发现中的重要工具。然而,市面上适用于小规模蛋白纯化的设备却很少。并且由于研究人员缺乏编程和自动化专业知识,可能会导致在建立 这些流程时产生很多不必要的开销,在优化工作流程时,会带来额外的成本负担。

PhyTip 柱是基于移液器吸头进行工作的色谱柱,通过移动相(例 如样品溶液)在固定相(即填充在尖端中的树脂)上的双向流动来 将目标生物分子与非目标分子分离,这个过程被称为双流层析。纯 化后的样品可以以小体积洗脱,从而得到高浓度的样品。双流层析 是一种温和的纯化过程,产生具有高生物活性的蛋白质。这些 PhyTip 柱利用了蛋白 A 进行抗体的纯化或富集。蛋白 A 是一种分 子量为49 kDa 的蛋白,对大多数 IgG 的 Fc 区域具有较高的亲和力。

ProPlus (MabSelectTM SuReTm,Cytiva)和ProPlus LX (MabSelect SuRe,Cytiva) 是使用经过改良的蛋白 A 制备吸头。蛋白 A 具有更强的结合目标 IgG 的能力,通常被用于抗体的纯化和富集。

金属亲和层析(IMAC) 是另一种常见的方法,用于从粗样品中纯 化或富集目标蛋白。这种方法利用金属离子提取具有基因工程标签 的重组蛋白,它们通常是能够螯合金属离子的肽序列。PhyTip柱与 镍离子(Ni)-IMAC 亲和树脂结合,通过 Ni2+ 和组氨酸碱基之间的强亲和力,高效纯化多组氨酸 (His) 标记的蛋白。

OT-2 是一个对生物学家非常友好的自动化平台。PhyTip 柱使用与 OT-2 的单通道和8通道移液器兼容的吸头,从而实现了在 OT-2 上 执行全自动蛋白纯化。本次研究对 PhyTip 柱在 OT-2 上的性能表现进行评估,并展示了该平台可适配多种应用的能力。通过PhyTip 柱与 OT-2 平台结合使用,研究人员能够实现自动化运 行蛋白质纯化,提高操作的便捷性和一致性。这为各种不同的应用提供了更适用的解决方案,并为高通量的纯化和富集提供了支持。

材料和方法
在 Opentrons OT-2 平台上使用PhyTip 色谱柱进行蛋白质纯化工作流程概述
该过程的第一部分是“试剂孔板准备”,用于准备 PhyTip 柱架和试 剂孔板。其中包括平衡缓冲液孔板、两个用于不同洗涤缓冲液的孔 板以及一个洗脱缓冲液孔板。该过程的第二部分是“蛋白质纯 化”,通过使用 PhyTip 柱进行双流层析来捕获和富集目标蛋白 质。这是通过使样品或缓冲液通过柱体内部的树脂(即上下移液) 而实现的。设置环节包括循环次数、流速和缓冲液体积,这些设置根据具体应用进行调整(表1)。

表1: PhyTip 柱在 Opentrons OT-2 上测试的设置和运行时间

PhyTip 柱在 Opentrons OT-2 上测试的设置和运行时间
PhyTip 柱在 Opentrons OT-2 上测试的设置和运行时间

试剂孔板制备和蛋白质纯化方案的 OT-2 平台布局示意图(图1)
在这项研究中测试的 PhyTip 柱型号包括:
● Pro A 20μL PTX-93-20-01
● ProPlus 20 μL PTX-93-20-07
● ProPlus LX 20 μL PTX-93-20-26
● Ni-IMAC 20 μL PTX-93-20-03

蛋白质纯化流程
1.取出 PhyTip 柱
2.平衡化
3.捕获目标蛋白质
4.洗涤(第一次)
5.洗涤(第二次)
6.洗脱

蛋白质纯化流程图

实验结果
分离 His 标记的 GAPDH, 同时保留活性通过 SDS-PAGE 和蛋白定量分析,我们得出了在 PBS 中提取的 带有 His 标签的 GAPDH 样品具有理想产量和一致性的结论(平均产量为79%,变异系数为3%) (图2上部)。

从细菌裂解液中分离 His 标记的 GAPDH生产重组蛋白的常见方法是用质粒转化大肠杆菌
OT-2 平台上使用 PhyTip 柱没有破坏酶活性,这是通过 GAPDH活性测定得出的结果(图2中部)。此外,结果还表明,在两种不同蛋白质的样品中均能够成功地将 His 标记的 GAPDH 与非目标蛋白的BSA 分离开来(图2下部)。

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