利用OT-2上的®DNA制备试剂盒自动制备小基因组的DNA文库

作者
马修·阿卡纳,金纳里·沃森博士,莫拉约·阿德伊比博士。

介绍
下一代测序(NGS)的工作流程包括使用市售软件制备DNA文库以及经济有效的DNA制备试剂盒。通过使用自动化的OT-2协议来优化这个工作流很有帮助以提高DNA文库的制备效率。
在这里,我们描述了伊利®DNA的效率。准备工具包(Illumina,CatNo。20018705)在OT-2,机器人液体处理平台上,自动执行标记工作流程。使用OT-2的高性能能力自动化此过程提供了一个快速和健壮的工作流程,生成用于基因组测序的统一DNA准备文库。

照明®DNA准备试剂盒和外中心OT-2平台概述
伊利®专利NGS标记工作流程实现了利用珠子进行的珠上标记链接的转座体。珠链的化学性质转座体对DNA片段化更有效和DNA末端修复与之前的溶液内标记工作流程相比。该DNA片段使用双索引适配器进行标记,这是一种独特的条形码分配每个DNA片段。DNA Prep样本(n=8)分别为量化,归一化到一个4nM的库,汇集到一个单个多路复(8倍或16倍)样品,然后在Illumina®MiSeq上的2x75流细胞上进行基因组测序。我们的数据显示了所有数据的低可变性,PNA扩增前后测定的DNA制备样本;条形码平衡,以及统一和高覆盖率的测序比对。参考基因组的研究表明,使用OT-2协议的自动标记为基因组测序提供了一个高质量的DNA准备文库。

OT-2工作流协议的原理图
DNA和IDT®对®DNA/RNA UD指数集A的DNA和IDT®。20027213)在孵育期间一个被称为标记的过程,在OT-2上,如图(图1)所示。进行了标记清洗步骤,以去除残留的DNA和适配器。下一个的用OT-2方法进行DNA扩增具有可编程盖和块温度的甲板上热循环器。

Illumina DNA准备工作流程
图1. Illumina DNA准备工作流程。虚线框表示在OT-2上自动化的Illumina DNA准备工作流程的步骤

按照OT-2方案,进行后扩增
使用AMPure(贝克曼库尔特,猫。不a63881)根据制造商进行检测推荐DNA Prep样本被定量,归一化至4nM(使用NEBNext®文库定量试剂盒对伊利®文库定量进行qPCR测定试剂盒,以8倍或16倍的形式汇集成单个样本,然后在伊利®MiSeq上的2x75流池上运行。根据伊利®DNA/RNA独特双(UD)索引适配器条形码序列,提取测序数据并进行解复用。与参考基因组和覆盖图谱对齐的序列是通过真真品2021.2.2

工作流布局
OT-2平台的布局包括模块,实验室软件,和伊利米纳®DNA准备试剂,如详见(图2)。虽然该工作流包括:在OT-2上进行自动移液,人工干预是需要在甲板上的之间移动样品板热循环笔和磁块,并在协议期间重置移液管尖端架。

DNA制备样本的PCR扩增
采用伊利®DNA制备试剂盒构建OT-2上的Lambda DNA文库(n=8,100 ng)。分别定量前后PCR浓度(ng/uL)5个周期的PCR扩增,和DNA浓度使用Quant-iT™dsDNA高灵敏度检测试剂盒(热费雪科学公司,Cat。No.Q33120)在一个Qubit®上确定变异系数,即标准差除以整个样本的平均值。Lambda DNA样本的PCR前平均浓度为2.92,变异系数(CV)为10.4%,5个周期后的PCR后浓度平均为28.23,CV为10.7%,见(表1)。这些结果很简单,优化后的OT-2协议可以产生一个高质量和可靠的NGS DNA准备库。

DNA制备文库的小基因组测序
对96个样本的®DNA制备试剂盒(M)进行标记。用No. 20018705)制备了大肠杆菌非甲基化基因组DNA (Zymogen,Cat。. 不. 样品(n=16,100ng)

甲板布局配备模块、实验室器皿和Illumina DNA准备试剂
图2.OT-2甲板布局配备模块、实验室器皿和Illumina DNA准备试剂。

这个工作流在OT-2上都有自动的移液功能,需要手动操作在甲板上移动样品板(1)和磁性磁块(2),以及复位在运行期间的尖端机架。甲板布局包括1个NEST 12井水库,1个96井铝块,1倍埃彭多夫热循环器上的200ul PCR板,和一个1xNEST0.1 mL PCR板上温度模块(3)。模块包括一个磁性模块、温度模块、热循环器模块,以及P20和P300多通道移液管。

实验结果数据
表1.两者之间的低变异性库构建在Opentrons OT-2.该表显示了每个样品在Illumina标签清洗后的收率经过5个周期的PCR扩增和AMPure清除
小基因组的测序批次规格显示出低变异
表2.小基因组的测序批次规格显示出低变异。用Illumina DNA制备工作流程在OT-2上制备的3个不同批次的比较(1)。来自不同样品类型的产量是一致的(2),单独的样本条形码也显示了统一的表示方式(3)。平均样本基因组覆盖率近似于从Illumina覆盖率计算器计算出的预期覆盖率。
在小基因组中具有高度一致的测序覆盖率
图3.在小基因组中具有高度一致的测序覆盖率。来自基因组的覆盖图显示~7800x的Lambda基因组覆盖48kb

两批,第二批,E。. 大肠杆菌DNA样本
(n=8,100 ng)在OT-2上的2个单独的列上进行处理,以解释列内可能出现的可变性。
E. 大肠杆菌DNA(n=16,100 ng)和Lambda DNA (n=8,100ng)被扩增、归一化,并汇集到一个单一的多路复用(8倍或16倍)样本中进行测序。
对三个DNA制备批次的测序结果为比较确定样品产量,条形码
. 平衡和覆盖率,如(表2)所示,对DNA制备文库观察到统一的产量。计算了E的样本产量。8号试验室的大肠杆菌含量分别为9.75和3.79
. 16倍;8倍和16倍®适配器条码的CV值分别为8.77%和6.2%,显示8倍和16倍样本的平衡是准确的8倍的平均11.2%-12.31%,相比之下,预期的为12.5%。对于16-plex,根据伊利®参考计算的6%的期望值为6.2%。DNA的平均基因组覆盖率准备了E。大肠杆菌样本的8倍为150倍,16倍为45倍
. 此外,Lambda 48kb基因组的覆盖图谱显示~为7800倍,这表明对齐的序列reads水平较高(图3)。总的来说,这表明在OT-2上构建的用于测序的DNA Prep文库与参考计算相比显示出一致性(图4)。

统一的样本条码表示方式
图4.统一的样本条码表示方式。这个饼图展示了通过总体读取的排序运行中的均匀样本条形码平衡百分比

结论
我们演示了它的高性能和性能。在视中心OT-2上使用伊利umina®DNA准备试剂盒自动标记过程。我们展示了DNA Prep样本显示出低变异性,条形码平衡性,以及序列比对的高覆盖率。自动化这个全面的NGS工作流在的上OT-2将DNA文库制备过程中的风险降至最低,同时确保基因组的DNA文库制备质量先后顺序

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