负担得起的COVID-19测试使用OT-2的自动化

摘要
利用Opentron的OT-2和平台,我们展示了一种高度敏感、经济实惠的管道,用于基于pcr的SARS-CoV-2检测。

主要发现
.该管道可以在所有目标上检测到微量病毒至0.5拷贝/μLwith,≥准确率为96%,表明OT-2的灵敏度可与其他自动化系统媲美。
.一个冠状病毒交叉反应性小组展示了该病毒与SARS、MERS和人类冠状病毒229E相比,SARS-冠状病毒2检测的特异性,NL63和OC43。
.在3小时内完成了96个样本的病毒RNA提取,平均阈值周期(Ct)为36个,平均标准差为1.0,平均变异系数(CV)为2.8%。

介绍
由SARS-CoV-2引起的COVID-19世界卫生宣布全球大流行。
2020年3月11日的组织机构(1)。从那时起,那里一直是全球对大规模发展的高度重视,高通量测试。而许多预防措施诸如社交距离和口罩强制要求等措施已在世界上许多国家得到执行,大规模检测已被证明是最大限度地减少疾病传播和对全球经济和公共卫生的威胁的有力选择。如南方的国家
韩国(2)和新加坡(3)已经扩大了非凡的测试工作,并已成为遏制的模式疾病预计还会有一种可靠的疫苗,还有几个月的时间(4个)和大量的测试选择显示出很高的假阴性率(5个),增加可靠的测试选项的数量是至关重要的。

在本研究中,我们举例说明了一个简单和可重复的方法
使用Opentrons OT-2、模块和实验室软件的基于SARS-CoV-2 RT-PCR的检测策略。这种自动友好的工作流程是非常敏感的,令人难以置信的实惠,并且可以对增加测试提供不可估量的帮助
全球能力。

材料和方法
合成SARSCoV-2 RNA对照2(Twist生物科学)和合成,合成阳性样本。鼻基质(SNM)(6),每个样本包含200个μL裂解缓冲液和35 μL蛋白酶K(PK)。SNM与Nuttada等人(6)中概述的内容类似。(SNM: 110 mM氯化钠,1% w/v粘蛋白从猪胃II型(Sigma M2378-100G)和10 μg/mL w/v人类基因组DNA(Coriell NA12878)在90% v/v的TE/SNMEeach样品在室温下孵育15分钟进行裂解。

RNA提取使用Promega进行®HT病毒TNA试剂盒,裂解后立即发生。在样品中加入珠子和异丙醇后,在OT-2上暂停发生了混合盘子10分钟的关闭甲板涡旋器。一旦混合完成,OT-2每个样品在65 μL中洗脱。. 这个OT-2在左侧使用了gen2p300 8通道移液管安装多达10个200 μL过滤器运行,包括GEN2磁性模块和GEN2温度模块(图1)。总运行时间,包括动手操作时间和裂解时间,在1小时到3.5小时之间变化(图2)。

美国疾病预防控制中心(CDC)的引物和探针:
.2019-nCoV_N1-F (GACCCCAAAATCAGCGAAAT)
.2019-nCoV_N1-R (TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG).2019-nCoV_N1P (FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1)
•2019-nCoV_N2-F (TTACAAACATTGGCCGCAAA)
•2019nCoV_N2-R (GCGCGACATTCCGAAGAA)
•2019-nCoV_N2-P (FAMACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGBHQ1)
•RP-F (AGATTTGGACCTGCGAGCG)
•RP-R (GAGCGGCTGTCTCCACAAGT)
•RP-P (FAM-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1)

它们是从集成DNA技术公司订购的(IDT,2019-nCoV CDC EUA试剂盒)。N1、N2和RNase P以推荐的浓度进行预混2019-由CDCnCoV N 阳性对照(GenBank:NC_045512.2)和Hs_RPP30阳性对照均来自IDT,分别用于SARS-CoV-2阳性对照和人RNA阳性对照。一步入门版™III RT-PCR试剂盒(Takara Bio Inc.)

在Takara或Luna®通用探针一步RT-qPCR试剂盒(NEB)以Lista、Maria Jose等人测试的推荐浓度使用(7)。下面的程序是否进行RT-PCR检测:逆转录结果为在55°C下进行10分钟。初始变性是在95°C下变性1分钟,然后在95°C下变性50次循环10秒,然后退火30秒60°C.

柏林Charite/世界卫生组织(WHO)的引物和探针:
•E_Sarbeco_F1 (ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT)
•E_Sarbeco_R2 (ATATTGCAGCAGTACGCACACA)
•E_Sarbeco_P1 (FAM-ACACTAGCTCATCCTTACTGCTTCGBBQ)
•RdRP_SARSr-F2 (GTGARATGGTCATGTGTGGCGG)

管道甲板设置

图1:易于采用基于SARS-CoV-2pcr的检测管道A。
该管道从合成样品开始。在……之后将样品重新格式化为NEST 96深井板2 mL,样品在室温下保存15分钟进行裂解,然后使用视转子GEN2磁性模块和GEN2温度模块对OT-2进行RNA提取。最后,在RT-qPCR机器上进行RT-PCR。B.OT-2上的这个布局包括GEN2p300 8通道移液管、GEN2温度模块和GEN2磁性模块。实验室软件的要求包括多达10个200μL过滤顶,1个NEST 1井水库195 mL,一个NEST2 mL深井板,两个NEST 12井水库15 mL,一个NEST96孔板100µL PCR全裙。总的来说,每个样本的总人工制品成本为14.35美元。

样本数据

图2:快速完成在Opentrons OT-2上的COVID测试。
准备时间和样本重新格式化的时间在10分钟到40分钟之间,这取决于吞吐量。裂解的时间总是15分钟。运行时间,描述为OT-2执行运行所需的时间,在8个样本的37分钟到96个样本的2小时到38分钟之间变化。总的来说,96个样品可以在大约3.5小时内准备和提取。

原文地址:负担得起的COVID-19测试使用OT-2的自动化

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